老哥俱乐部

实验报告：

一
、分离与培养

：

1、无菌条件下
，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织

，然后用PBS将此组织块清洗2次，将组织剪成1mm3左右大小；

2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶），混悬10s
，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液
，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液
，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次
，直至组织被消化；

4

、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min

，弃去上清
，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬
，接种于25cm2培养瓶

，放置于37℃ 
，5％CO2 培养箱中培养

；

5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；二
、免疫荧光鉴定：

1

、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次
，每次10min
，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下
，用0.1％Triton X-100透膜15min

；

3、PBS冲洗细胞2次
，每次10min，然后在室温条件下
，用4% BSA封闭细胞30min

；

4
、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；

5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；

6
、用PBS冲洗3次
，每次10min，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

细胞简介：

小鼠脐动脉平滑肌分离自脐带组织；它是脐动脉的重要结构组成细胞之一
，在机体的正常生理过程中发挥着重要作用。脐带是哺乳类的连接胎儿和胎盘的管状结构，脐带中通过尿膜的血管即脐动脉和脐静脉，卵黄囊的血管即脐肠系膜动脉及脐肠系膜静脉。在子宫中
，子宫动脉在胎盘的母体部分出的毛细血管，与胎盘的子体部胎儿毛细血管靠近，在此处母体和胎儿的血液间进行CO2和O2，代谢产物即代谢废物和营养物质的交换
。脐动脉将胎儿产生的废物运送至胎盘

，脐静脉将O2和营养物质从胎盘运送给胎儿。由于脐带是分娩过程中的废弃物，同时从脐带中分离脐静动平滑肌细胞方法相对成熟，使得体外培养的脐动脉平滑肌细胞作为研究血管的模型细胞。脐动脉平滑肌细胞原代分离培养3天后，可见细胞贴壁伸展，细胞形态大小不一

，呈梭形、不规则形、三角形或扇形，核卵圆形、居中；2周后细胞汇合，多数细胞伸展呈长梭形，胞浆丰富，有分枝状突起
，细胞平行排列成单层或部分区域多层重叠生长，高低起伏

；细胞密度低时，常交织成网状
；密度高时，则排列为旋涡状或栅栏状。传代后细胞生长较快

，4-6天即可汇合，并保持上述形态学特征和生长特点
。

方法简介
：

实验室分离的小鼠脐动脉平滑肌采用-胶原酶联合消化法结合差速贴壁法制备而来
，细胞总量约为5×10⁵cells/瓶
。

质量检测

实验室分离的小鼠脐动脉平滑肌经α-SMA免疫荧光鉴定
，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1

、HBV、HCV、支原体
、细菌、酵母和真菌等。

培养信息
：

培养基：含FBS、生长添加剂
、Penicillin、Streptomycin等

换液频率：每2-3天换液一次

生长特性
：贴壁

细胞形态：成纤维细胞样

传代特性
：可传2-3代左右

消化液：0.25%

培养条件
：气相：空气，95%；CO2
，5%

小鼠脐动脉平滑肌体外培养周期有限
；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养
，以此保证该细胞的佳培养状态。

注意事项
：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液
、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和老哥俱乐部联系。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态
、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等
，确保细胞培养条件一致
，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担
。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态。因运输问题，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片
，是正常现象。观察好细胞状态后
，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h。

4. 贴壁细胞可以消化，悬浮细胞直接混匀收集细胞，900 rpm-1000 rpm离心3 min，弃上清。加5 mL PBS重悬细胞
，再900 rpm-1000 rpm离心3 min
，
，用新鲜的*培养基重悬细胞，并接种到新的培养瓶或培养皿中，置于培养箱中进行培养。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态
，便于和我司技术部沟通交流。由于运输的原因
，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和老哥俱乐部联系
，告知细胞的具体情况
，以便老哥俱乐部的技术人员跟踪回访直至问题解决。

7. 该细胞仅供科研使用。

8. 备注：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞

。收到细胞后次传代建议1
：2传代
。

9.注意
： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿
。不是1个T25瓶传2个10cm皿。

公司正在出售的产品：

大鼠Ⅳ型胶原(Col Ⅳ)检测试剂盒
，英文名： Col Ⅳ ELISA Kit

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CLIAKitforHumahrombinactivatablefibrinolysisinhibitor,TAFIELISAKit人纤溶抑制因子/激活的纤溶抑制物

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Human hyaluronidase (HAase) ELISA Kit 人透明质酸酶(HAase)检测试剂盒

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小鼠脐动脉平滑肌细胞兔子Ⅱ(FⅡ)ELISAKit   ELISA.   96T/48T

兔子C反应蛋白(CRP)ELISAKit   ELISA.   96T/48T

兔子内皮型合成酶3(eNOS-3)ELISAKit   ELISA.   96T/48T

兔子酯转移蛋白(CETP)ELISAKit   ELISA.   96T/48T