老哥俱乐部

实验报告：

一、分离与培养：

1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次
，将组织剪成1mm3左右大小
；

2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶）
，混悬10s
，置37℃条件下消化10min
，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清
，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

3
、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液
，混悬10s，置37℃消化10 min后
，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织被消化
；

4

、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液
，1200r/min 离心10min
，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬
，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；

5、差速贴壁1h后
，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；二、免疫荧光鉴定：

1

、待心房肌细胞生长至80%融合时
，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min
，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

2
、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min
；

4

、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；

5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗
， 37℃条件下放置1h；

6、用PBS冲洗3次
，每次10min
，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

细胞简介：

小鼠肝窦内皮分离自肝脏组织；肝脏是身体内以代谢功能为主的一个器官，并在身体里面起着去氧化、储存肝糖
、分泌性蛋白质的合成等作用；肝脏也制造消化系统中之胆汁。肝脏是机体内脏里大的器官，位于机体中的腹部位置
，在右侧横隔膜之下，位于胆囊之前端且于右边肾脏的前方，胃的上方。肝脏是机体消化系统中大的消化腺
，为一红棕色的V字形器官。肝脏是尿素合成的主要器官，又是新陈代谢的重要器官。肝脏在机体位置和形态结构
：肝脏位于右上腹，隐藏在右侧膈下和肋骨深面，大部分肝为肋弓所复盖，仅在腹上区、右肋弓间露出并直接接触腹前壁
，肝上面则与膈及腹前壁相接。肝窦内皮细胞（SEC）是肝脏内所占比例高的非实质细胞，位于肝窦腔与肝细胞之间，具有物质转运
、吞噬、抗原提呈、免疫耐受等功能
。SEC由于拥有一般细胞所没有的窗孔结构
、细胞间连结松散、内皮下缺少基底膜而使其具有高度通透性，从而达到快速交换各种大小分子的目的。肝在遭到多种病原侵袭时，肝窦内皮细胞窗孔逐渐减少或消失，内皮下基膜形成，产生类似于连续型毛细血管的结构
，这一过程称为肝窦毛细血管化

。它由多种因素引起，其过程极复杂
，在多种肝病的发病前期阶段均有出现，近年来受到广泛关注。

方法简介


：

公司实验室分离的小鼠肝窦内皮采用混合酶灌流消化、反复低速离心
、密度梯度离心法
，并通过内皮细胞专用培养基培养筛选制备而来，细胞总量约为5×10?cells/瓶。

质量检测

公司实验室分离的小鼠肝窦内皮经CD31、CD14免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV
、支原体、细菌
、酵母和真菌等。

培养信息：

包被条件 PLL（0.1mg/ml），明胶（0.1%）

培养基 含FBS
、生长添加剂、Penicillin
、Streptomycin等

换液频率 每2-3天换液一次

生长特性 贴壁

细胞形态 内皮细胞样

传代特性 可传1-2代

消化液 0.25%

培养条件 气相：空气
，95%；CO2，5%

注意事项：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和老哥俱乐部联系。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态
、所用培养基、血清比例
、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面

，显微镜下观察细胞状态

。因运输问题，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片
，是正常现象
。观察好细胞状态后
，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h

。

4. 贴壁细胞可以消化

，悬浮细胞直接混匀收集细胞，900 rpm-1000 rpm离心3 min，弃上清
。加5 mL PBS重悬细胞

，再900 rpm-1000 rpm离心3 min
，

，用新鲜的*培养基重悬细胞，并接种到新的培养瓶或培养皿中，置于培养箱中进行培养

。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养
。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态
，便于和我司技术部沟通交流
。由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况
，请及时和老哥俱乐部联系，告知细胞的具体情况
，以便老哥俱乐部的技术人员跟踪回访直至问题解决。

7. 该细胞仅供科研使用
。

8. 备注

：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞。收到细胞后次传代建议1

：2传代 。

9.注意： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿
。不是1个T25瓶传2个10cm皿

。

公司正在出售的产品：

总蛋白定量测定试剂盒（带标准：BCA法）（比色法）

总超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒（WST-1法）

乳酸（lacticacid）测定试剂盒（测血清、组织等）（比色法）

羟脯酸（Hyp）测定试剂盒（碱水解法）（测动物血清、组织、尿液）

猪孕酮(PROG)试剂盒

Human erythrocyte membrane protein (EMP) ELISA Kit 人红细胞膜蛋白(EMP)试剂盒

RabbitComplemefragme3a,C3aELISAKit 兔子补体片断3a(C3a)试剂盒 进口分装

CLIAKitforAPF(Humanai-perinuclearfactor)ELISAKit人抗核周因子抗体

血清钙比色法定量试剂盒50次

PorcineIerleukin6,IL-6ELISAKit猪白介素6(IL-6)试剂盒

IL1B重组食蟹猴 IL-1 beta / IL1B 蛋白 Protein

MMP-9(matrix metalloproteinase 9 0.5mgMMP-9(matrix metalloproteinase 9) 基质金属蛋白酶-9(抗原)

WFDC2重组人 WAP5 / WFDC2 / HE4 蛋白 (His 标签) Protein

BTK Protein Human 重组人 Bruton Tyrosine Kinase / BTK Kinase 蛋白 (His 标签)

HGF Protein Mouse 重组小鼠 HGF / Hepatocyte Growth Factor 蛋白 (His 标签)

泛素激活酶样蛋白(UBE1L)重组蛋白 Recombinant Ubiquitin Activating Enzyme E1 Like Protein (UBE1L)

BTK Protein Human 重组人 Bruton Tyrosine Kinase / BTK Kinase 蛋白 (His 标签)

NXPH1重组小鼠 Neurexophilin-1 / NXPH1 蛋白 (His 标签) Protein

IGFBP2 Protein Cynomolgus 重组食蟹猴 IGFBP2 蛋白 (His 标签)

PFN2重组人 Profilin 2 / PFN2 蛋白 (His 标签) Protein

小鼠肝窦内皮细胞大鼠果糖胺(FRA)试剂盒 
，英文名： FRA ELISA Kit

Rabbit inducible niic oxide syhase (iNOS) ELISA Kit 兔诱导型合成酶(iNOS)试剂盒

新型甲型H1N1流感病毒(IAV-H1N1)核酸试剂盒(PCR-荧光探针法) 48T

CLIAKitforMMP-8(HumanMaixmetalloproteinase8/Neuophilcollagenase)ELISAkit人基质金属蛋白酶8/粒细胞胶原酶

体液基质金属蛋白酶(MMP-1)活性荧光定量试剂盒20次

ELISAKitTM犬血栓调节蛋白