實驗報告 ：

一 、分離與培養 ：

1 、無菌條件下 ，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織 ，然後用PBS將此組織塊清洗2次 ，將組織剪成1mm3左右大小 ；

2 、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶） ，混懸10s ，置37℃條件下消化10min ，之後用滴管吹打製成單細胞懸液 ，自然沉澱並收集上清 ，用含10% FBS培養基終止消化後4℃放置 ；

3 、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液 ，混懸10s ，置37℃消化10 min後 ，按上述方法收集上清並終止消化後4℃放置 ，重複此步驟2-3次 ，直至組織被消化 ；

4、用200目不鏽鋼篩網過濾細胞消化液 ，1200r/min 離心10min ，棄去上清 ，沉澱細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養基混懸 ，接種於25cm2培養瓶 ，放置於37℃  ，5％CO2 培養箱中培養 ；

5 、差速貼壁1h後 ，吸出培養基 ，按實驗需要接種於6孔板中繼續培養 ；二 、免疫熒光鑒定 ：

1 、待心房肌細胞生長至80%融合時 ，棄去培養基 ，用溫育的PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min ；

2 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在4℃條件下 ，用0.1％Triton X-100透膜15min ；

3 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在室溫條件下 ，用4% BSA封閉細胞30min ；

4 、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗 ，然後將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜 ；

5 、PBS衝洗細胞3次 ，每次10min ，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗 ， 37℃條件下放置1h ；

6 、用PBS衝洗3次 ，每次10min ，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像並拍照 。

細胞簡介：

小鼠附睾上皮分離自附睾組織；附睾（Epididymis）是一個由曲折 、細小的管子構成的器官 ，一端接著輸精管（Ductusdeferens） ，一端接著睾丸（Testis）的曲細精管 ，具體結構主要包括輸出小管和附睾管 。附睾緊貼睾丸的上端和後緣 ，可分為頭 、體 、尾三部 。精子離開睾丸後通過輸出小管進入附睾 。附睾具有暫存精液並分泌附睾液營養精子的功能 ，以促進精子的進一步成熟附睾的功能是暫存精子，促進精子的進一步成熟 。精子在附睾內獲得運動能力 ，總共停留8～17天，終達到功能上的成熟 。在這個過程中 ，精子除了自身的因素 ，還受到附睾微環境的影響，這包括了一係列的物理 、化學變化和精子形態的改變 。可以說 ，附睾微環境正常穩定是附睾發揮促成熟這一功能的必要條件 。若附睾的功能發生異常 ，精子則不能成熟 ，引起不育 。附睾上皮含有主細胞 、基細胞 、亮細胞等幾種類型細胞 。基細胞 ，其頂部離附睾管腔有一定距離 ，在附睾各部分 ，其形態沒有差別 ，一般認為是貯備細胞 ；另一種主細胞 ，是維持附睾生理功能的物質基礎 ，在各區段的主細胞形態結構差別很大 ，這也反映出各區段的生理功能的差異 。除上皮細胞外 ，附睾的管壁組織結構也有規律性的變化 ，附睾管起始段平滑肌有自發地節律性收縮 ，而尾部平滑肌就沒有這種特點 ，僅在射精一瞬間出現強烈的節律收縮。作為負責提供適合精子成熟微環境的附睾 ，具有活躍的分泌與吸收功能 。其中 ，附睾上皮的電解質和水分的轉運 ，對保持附睾內合適的離子濃度和酸堿度 ，為精子成熟提供適宜的環境起著相當重要的作用 。睾丸的支持細胞每天能產生大量睾網液 ，如一隻公羊每天約能分泌40毫升睾網液 ，而從附睾排出的隻不過幾百微升 ，也就是說睾丸分泌液有99%被附睾上皮重新吸收回體內 。動物實驗表明 ，結紮輸精管時睾丸不會腫脹 ，但若結紮睾丸輸出小管 ，睾丸天就會腫脹 ，這就充分證實了附睾存在著強有力的吸收功能 ，但是重新吸收的意義尚不清楚 。體外培養附睾上皮細胞對精子的發育、成熟 ， ，附睾生理基礎功能研究具有重要意義 。

方法簡介 ：

實驗室分離的小鼠附睾上皮采用膠原酶消化結合差速貼壁法製備而來 ，細胞總量約為5×10⁵cells/瓶 。

質量檢測

實驗室分離的小鼠附睾上皮經PCK免疫熒光鑒定 ，純度可達90%以上 ，且不含有HIV-1 、HBV 、HCV 、支原體 、細菌 、酵母和真菌等 。

培養信息 ：

包被條件 ：鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培養基 ：含FBS 、EGF 、Hydrocortisone 、腎上腺素 、甲狀腺素 、Insulin 、Transferrin 、Selenium Solution 、Penicillin 、Streptomycin等

換液頻率 ：每2-3天換液一次

生長特性 ：貼壁

細胞形態 ：上皮細胞樣

傳代特性 ：可傳1-2代

消化液：0.25%

培養條件 ：氣相 ：空氣 ，95% ；CO2 ，5%

小鼠附睾上皮體外培養周期有限 ；建議使用配套的專用生長培養基及正確的操作方法來培養 ，以此保證該細胞的佳培養狀態 。

注意事項 ：

1. 收到細胞後首先觀察細胞瓶是否完好 ，培養液是否有漏液 、渾濁等現象 ，若有上述現象發生請及時和老哥俱樂部聯係 。

2. 仔細閱讀細胞說明書 ，了解細胞相關信息 ，如細胞形態 、所用培養基 、血清比例 、所需細胞因子等 ，確保細胞培養條件一致 ，若由於培養條件不一致而導致細胞出現問題 ，責任由客戶自行承擔 。

3. 用75%酒精擦拭細胞瓶表麵 ，顯微鏡下觀察細胞狀態 。因運輸問題 ，部分細胞由於溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片 ，是正常現象 。觀察好細胞狀態後 ，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置於37℃培養箱放置4-6h 。

4. 貼壁細胞可以消化 ，懸浮細胞直接混勻收集細胞 ，900 rpm-1000 rpm離心3 min ，棄上清 。加5 mL PBS重懸細胞 ，再900 rpm-1000 rpm離心3 min ， ，用新鮮的*培養基重懸細胞 ，並接種到新的培養瓶或培養皿中 ，置於培養箱中進行培養 。

5. 請客戶用相同條件的培養基用於細胞培養 。

6. 建議客戶收到細胞後前3天各拍幾張細胞照片 ，記錄細胞狀態 ，便於和我司技術部溝通交流 。由於運輸的原因，個別敏感細胞會出現不穩定的情況 ，請及時和老哥俱樂部聯係 ，告知細胞的具體情況 ，以便老哥俱樂部的技術人員跟蹤回訪直至問題解決 。

7. 該細胞僅供科研使用 。

8. 備注 ：運輸用的培養基(灌液培養基)不能再用來培養細胞 ，請換用按照說明書細胞培養條件新配製的*培養基來培養細胞 。收到細胞後次傳代建議1 ：2傳代  。

9.注意 ： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿 。不是1個T25瓶傳2個10cm皿 。

公司正在出售的產品 ：

大鼠脂肪酸合酶(FASN)檢測試劑盒  ，英文名 ： FASN ELISA Kit

Mouse soluble tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand (sAIL) ELISA Kit 小鼠可溶性腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(sAIL)檢測試劑盒

MouseInsulin-likegrowthfactorbindingprotein1,IGFBP-1ELISAKit 小鼠胰島素樣生長因子結合蛋白1(IGFBP-1)檢測試劑盒 96T/48T 進口分裝

CLIAKitforHumanHaptoglobin,Hpt/HPELISAKIT人結合珠蛋白/觸珠蛋白

比色法定量檢測試劑盒20次

ELISAKitbFGF-6大鼠堿性成纖維細胞生長因子6

EPHB4重組小鼠 EphB4 / HTK 蛋白 (Fc 標簽)(Fc 標簽) Protein

Anti-CSP (circumsporozoite protein/Plasmodium yoelii 0.5mgAnti-CSP (circumsporozoite protein/Plasmodium yoelii) 環子孢子蛋白(約氏瘧原蟲)抗原

UBE2L6重組人 UBCH8 / UBE2L6 蛋白 Protein

CSF1 Protein Human 重組人 / 食蟹猴 M-CSF / CSF-1 蛋白

CD99 Protein Rat 重組大鼠 CD99 蛋白 (Fc 標簽)

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小鼠前列腺素E1(PGE1)ELISA 試劑盒 96T/48T

Rat maix metalloproteinase 9/ gelatinase B (MMP-9/G 大鼠基質金屬蛋白酶9/明膠酶B(MMP-9/G

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真菌/酵母細胞染色質免疫沉澱分析(CHIP)試劑盒(包括抗體)10次

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小鼠附睾上皮細胞小鼠0酸化蛋白激酶C(P-PKC)檢測試劑盒   96T/48T   試劑盒   組裝/原裝

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小鼠淋巴細胞因子檢測試劑盒   96T/48T   試劑盒   組裝/原裝

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