老哥俱乐部

实验报告：

一、分离与培养
：

1
、无菌条件下
，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织
，然后用PBS将此组织块清洗2次，将组织剪成1mm3左右大小；

2

、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶），混悬10s
，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液
，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次
，直至组织被消化
；

4
、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液
，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬
，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养
；

5
、差速贴壁1h后
，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养
；二、免疫荧光鉴定：

1、待心房肌细胞生长至80%融合时

，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次
，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min
；

2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下
，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下
，用4% BSA封闭细胞30min
；

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜
；

5
、PBS冲洗细胞3次
，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗
， 37℃条件下放置1h；

6、用PBS冲洗3次，每次10min，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照
。

细胞简介
：

小鼠附睾上皮分离自附睾组织；附睾（Epididymis）是一个由曲折、细小的管子构成的器官，一端接着输精管（Ductusdeferens），一端接着睾丸（Testis）的曲细精管
，具体结构主要包括输出小管和附睾管。附睾紧贴睾丸的上端和后缘，可分为头、体
、尾三部。精子离开睾丸后通过输出小管进入附睾。附睾具有暂存精液并分泌附睾液营养精子的功能，以促进精子的进一步成熟附睾的功能是暂存精子
，促进精子的进一步成熟

。精子在附睾内获得运动能力，总共停留8～17天

，终达到功能上的成熟。在这个过程中
，精子除了自身的因素
，还受到附睾微环境的影响
，这包括了一系列的物理


、化学变化和精子形态的改变
。可以说
，附睾微环境正常稳定是附睾发挥促成熟这一功能的必要条件

。若附睾的功能发生异常
，精子则不能成熟，引起不育


。附睾上皮含有主细胞
、基细胞、亮细胞等几种类型细胞
。基细胞，其顶部离附睾管腔有一定距离，在附睾各部分
，其形态没有差别，一般认为是贮备细胞
；另一种主细胞，是维持附睾生理功能的物质基础
，在各区段的主细胞形态结构差别很大
，这也反映出各区段的生理功能的差异。除上皮细胞外，附睾的管壁组织结构也有规律性的变化，附睾管起始段平滑肌有自发地节律性收缩
，而尾部平滑肌就没有这种特点
，仅在射精一瞬间出现强烈的节律收缩。作为负责提供适合精子成熟微环境的附睾
，具有活跃的分泌与吸收功能。其中，附睾上皮的电解质和水分的转运，对保持附睾内合适的离子浓度和酸碱度，为精子成熟提供适宜的环境起着相当重要的作用

。睾丸的支持细胞每天能产生大量睾网液，如一只公羊每天约能分泌40毫升睾网液，而从附睾排出的只不过几百微升
，也就是说睾丸分泌液有99%被附睾上皮重新吸收回体内。动物实验表明
，结扎输精管时睾丸不会肿胀，但若结扎睾丸输出小管，睾丸天就会肿胀，这就充分证实了附睾存在着强有力的吸收功能，但是重新吸收的意义尚不清楚。体外培养附睾上皮细胞对精子的发育
、成熟，，附睾生理基础功能研究具有重要意义。

方法简介：

实验室分离的小鼠附睾上皮采用胶原酶消化结合差速贴壁法制备而来，细胞总量约为5×10⁵cells/瓶
。

质量检测

实验室分离的小鼠附睾上皮经PCK免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌
、酵母和真菌等
。

培养信息：

包被条件
：鼠尾胶原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培养基：含FBS、EGF、Hydrocortisone、肾上腺素、甲状腺素、Insulin、Transferrin、Selenium Solution
、Penicillin
、Streptomycin等

换液频率：每2-3天换液一次

生长特性
：贴壁

细胞形态：上皮细胞样

传代特性：可传1-2代

消化液：0.25%

培养条件：气相：空气，95%
；CO2，5%

小鼠附睾上皮体外培养周期有限
；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的佳培养状态。

注意事项：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象
，若有上述现象发生请及时和老哥俱乐部联系。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息
，如细胞形态
、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等

，确保细胞培养条件一致，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题
，责任由客户自行承担。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态
。因运输问题，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片，是正常现象。观察好细胞状态后
，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h。

4. 贴壁细胞可以消化，悬浮细胞直接混匀收集细胞，900 rpm-1000 rpm离心3 min，弃上清
。加5 mL PBS重悬细胞，再900 rpm-1000 rpm离心3 min，，用新鲜的*培养基重悬细胞，并接种到新的培养瓶或培养皿中，置于培养箱中进行培养
。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流。由于运输的原因
，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和老哥俱乐部联系，告知细胞的具体情况，以便老哥俱乐部的技术人员跟踪回访直至问题解决
。

7. 该细胞仅供科研使用

。

8. 备注：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞。收到细胞后次传代建议1
：2传代 。

9.注意： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿
。不是1个T25瓶传2个10cm皿

。

公司正在出售的产品
：

大鼠脂肪酸合酶(FASN)检测试剂盒 ，英文名： FASN ELISA Kit

Mouse soluble tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand (sAIL) ELISA Kit 小鼠可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(sAIL)检测试剂盒

MouseInsulin-likegrowthfactorbindingprotein1,IGFBP-1ELISAKit 小鼠胰岛素样生长因子结合蛋白1(IGFBP-1)检测试剂盒 96T/48T 进口分装

CLIAKitforHumanHaptoglobin,Hpt/HPELISAKIT人结合珠蛋白/触珠蛋白

比色法定量检测试剂盒20次

ELISAKitbFGF-6大鼠碱性成纤维细胞生长因子6

EPHB4重组小鼠 EphB4 / HTK 蛋白 (Fc 标签)(Fc 标签) Protein

Anti-CSP (circumsporozoite protein/Plasmodium yoelii 0.5mgAnti-CSP (circumsporozoite protein/Plasmodium yoelii) 环子孢子蛋白(约氏疟原虫)抗原

UBE2L6重组人 UBCH8 / UBE2L6 蛋白 Protein

CSF1 Protein Human 重组人 / 食蟹猴 M-CSF / CSF-1 蛋白

CD99 Protein Rat 重组大鼠 CD99 蛋白 (Fc 标签)

Anti-CSP (circumsporozoite protein/Plasmodium yoelii 0.5mgAnti-CSP (circumsporozoite protein/Plasmodium yoelii) 环子孢子蛋白(约氏疟原虫)抗原

CSF1 Protein Human 重组人 / 食蟹猴 M-CSF / CSF-1 蛋白

EPHB4重组小鼠 EphB4 / HTK 蛋白 (Fc 标签)(Fc 标签) Protein

CD99 Protein Rat 重组大鼠 CD99 蛋白 (Fc 标签)

UBE2L6重组人 UBCH8 / UBE2L6 蛋白 Protein

小鼠前列腺素E1(PGE1)ELISA 试剂盒 96T/48T

Rat maix metalloproteinase 9/ gelatinase B (MMP-9/G 大鼠基质金属蛋白酶9/明胶酶B(MMP-9/G

Humandeoxyribonucleicproteinaibody,DNP-AbELISAKit 人抗脱氧核糖核蛋白抗体(DNP-Ab)检测试剂盒 96T/48T 进口分装

Hamstermaixmetalloproteinase9/GelatinaseB,MMP-9ELISAK仓鼠基质金属蛋白酶9/明胶酶B(MMP-9/GelatinaseB)检测试剂盒规格：96T/48T

真菌/酵母细胞染色质免疫沉淀分析(CHIP)试剂盒(包括抗体)10次

MouseBonemorphogeneticprotein2,BMP-2ELISAKit小鼠骨成型蛋白2(BMP-2)检测试剂盒规格：96T/48T

小鼠附睾上皮细胞小鼠0酸化蛋白激酶C(P-PKC)检测试剂盒   96T/48T   试剂盒   组装/原装

小鼠0酸化基末端蛋白激酶(P-JNK)检测试剂盒   96T/48T   试剂盒   组装/原装

小鼠淋巴细胞因子检测试剂盒   96T/48T   试剂盒   组装/原装

小鼠淋巴细胞趋化因子(Lptn/LTN/XCL1)检测试剂盒   96T/48T   试剂盒   组装/原装