實驗報告 ：

一 、分離與培養 ：

1 、無菌條件下 ，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織 ，然後用PBS將此組織塊清洗2次 ，將組織剪成1mm3左右大小 ；

2 、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶） ，混懸10s ，置37℃條件下消化10min ，之後用滴管吹打製成單細胞懸液 ，自然沉澱並收集上清 ，用含10% FBS培養基終止消化後4℃放置 ；

3 、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液 ，混懸10s ，置37℃消化10 min後 ，按上述方法收集上清並終止消化後4℃放置 ，重複此步驟2-3次 ，直至組織被消化 ；

4 、用200目不鏽鋼篩網過濾細胞消化液 ，1200r/min 離心10min ，棄去上清 ，沉澱細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養基混懸 ，接種於25cm2培養瓶 ，放置於37℃  ，5％CO2 培養箱中培養 ；

5 、差速貼壁1h後 ，吸出培養基 ，按實驗需要接種於6孔板中繼續培養 ；二 、免疫熒光鑒定 ：

1 、待心房肌細胞生長至80%融合時 ，棄去培養基 ，用溫育的PBS衝洗細胞2次，每次10min ，然後用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min ；

2 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在4℃條件下 ，用0.1％Triton X-100透膜15min ；

3 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在室溫條件下 ，用4% BSA封閉細胞30min ；

4 、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗 ，然後將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜 ；

5 、PBS衝洗細胞3次 ，每次10min ，按1 ：150的比例稀釋抗α-actin的二抗 ， 37℃條件下放置1h ；

6 、用PBS衝洗3次 ，每次10min ，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像並拍照 。

細胞簡介 ：

小鼠肺微血管平滑肌分離自肺組織 ；肺是機體的呼吸器官 ，位於胸腔 ，左右各一 ，覆蓋於心之上 。肺有分葉 ，左二右三 ，共五葉 。肺經肺係（指氣管 、支氣管等）與喉 、鼻相連 ，故稱喉為肺之門戶 ，鼻為肺之外竅 。肺血管平滑肌細胞原代分離培養3天後 ，可見細胞貼壁伸展 ，細胞形態大小不一 ，呈梭形 、不規則形 、三角形或扇形 ，核卵圓形 、居中；2周後細胞匯合 ，多數細胞伸展呈長梭形 ，胞漿豐富 ，有分枝狀突起 ，細胞平行排列成單層或部分區域多層重疊生長 ，高低起伏 ；細胞密度低時 ，常交織成網狀 ；密度高時 ，則排列為旋渦狀或柵欄狀 。傳代後細胞生長較快 ，4-6天即可匯合 ，並保持上述形態學特征和生長特點 。肺血管平滑肌細胞主要功能 ：①細胞表麵表達介質（ICAM-1和VCAM-1）參與血管壁炎症反應 ；②是多數重要動脈疾病的靶細胞 。肺血管平滑肌細胞與主要病生理變化 ：①平滑肌增生易致肺動脈高壓 ；②先天性肺動脈狹窄 ；③肺動脈栓塞 。血管平滑肌細胞的加速生長潛能是血管疾病進展的關鍵因素 ，新研究表明血管平滑肌細胞表達的ICAM-1和VCAM-1能促進血管壁的炎症反應 ，並且與血管疾病的發展及穩定性有關 。

方法簡介 ：

實驗室分離的小鼠肺微血管平滑肌采用混合膠原酶消化法製備而來 ，細胞總量約為5×10⁵cells/瓶 。

質量檢測

實驗室分離的小鼠肺微血管平滑肌經α-SMA免疫熒光鑒定 ，純度可達90%以上 ，且不含有HIV-1 、HBV 、HCV 、支原體 、細菌 、酵母和真菌等 。

培養信息 ：

培養基 ：基礎培養基 ，含FBS 、EGF 、bFGF 、IGF 、VEGF 、Heparin 、Hydrocortisone 、Penicillin 、Streptomycin等

換液頻率 ：每2-3天換液一次

生長特性 ：貼壁

細胞形態 ：成纖維細胞樣

傳代特性 ：可傳1-2代左右

消化液 ：0.25%

培養條件 ：氣相 ：空氣 ，95% ；CO2 ，5%

小鼠肺微血管平滑肌體外培養周期有限 ；建議使用配套的專用生長培養基及正確的操作方法來培養 ，以此保證該細胞的佳培養狀態 。

注意事項 ：

1. 收到細胞後首先觀察細胞瓶是否完好 ，培養液是否有漏液 、渾濁等現象，若有上述現象發生請及時和老哥俱樂部聯係 。

2. 仔細閱讀細胞說明書 ，了解細胞相關信息 ，如細胞形態 、所用培養基 、血清比例 、所需細胞因子等 ，確保細胞培養條件一致 ，若由於培養條件不一致而導致細胞出現問題 ，責任由客戶自行承擔 。

3. 用75%酒精擦拭細胞瓶表麵 ，顯微鏡下觀察細胞狀態 。因運輸問題 ，部分細胞由於溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片 ，是正常現象 。觀察好細胞狀態後 ，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置於37℃培養箱放置4-6h 。

4. 貼壁細胞可以消化 ，懸浮細胞直接混勻收集細胞 ，900 rpm-1000 rpm離心3 min ，棄上清 。加5 mL PBS重懸細胞 ，再900 rpm-1000 rpm離心3 min ， ，用新鮮的*培養基重懸細胞 ，並接種到新的培養瓶或培養皿中 ，置於培養箱中進行培養 。

5. 請客戶用相同條件的培養基用於細胞培養 。

6. 建議客戶收到細胞後前3天各拍幾張細胞照片 ，記錄細胞狀態 ，便於和我司技術部溝通交流 。由於運輸的原因 ，個別敏感細胞會出現不穩定的情況 ，請及時和老哥俱樂部聯係 ，告知細胞的具體情況 ，以便老哥俱樂部的技術人員跟蹤回訪直至問題解決 。

7. 該細胞僅供科研使用 。

8. 備注 ：運輸用的培養基(灌液培養基)不能再用來培養細胞 ，請換用按照說明書細胞培養條件新配製的*培養基來培養細胞 。收到細胞後次傳代建議1 ：2傳代  。

9.注意 ： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿 。不是1個T25瓶傳2個10cm皿 。

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