兔主動脈平滑肌培養血管壁可分為內膜 、中膜與外膜三層 。內膜由內皮 、內皮下層和內彈性膜組成 ；中膜由平滑肌 、彈性纖維和膠原纖維組成；外膜為結締組織 ，與周圍的結締組織相連 。除去血管內膜和外膜後 ，即為血管平滑肌細胞層 。體外培養可使平滑肌細胞持續存活與生長 ，並保持血管平滑肌細胞在體的某些特性 ，便於研究 。本節以兔主動脈平滑肌細胞為例介紹培養法 。

一 、材料與試劑

(一)材料

動物家兔(大鼠 、豬等動物亦可) 。

(二)培養液與試劑

1．MEM培養液添加水解乳蛋白 、 、小牛血清(原代培養時加20％ ，傳代培養時加10％) ，(100IU／ml)和(100μg／ml) ，以NaHCO3溶液調pH至7．2 。

2．Hanks液

3．消化液0．15％ ；0．2％膠原酶 ；0．15％胰蛋白與O．020%EDTA等量混合液 。

4．培養皿 、培養瓶及手術器具等 。

二 、培養方法

(一)動脈血管壁中膜的製備

1．將家兔乙醚麻醉後固定 ，乙醇消毒胸腹部 ，沿胸骨切開胸腔 ，找到主動脈 ，兩端結紮 ，無菌切下主動脈血管．放入含有Hanks液的平皿中 。

2．將取下的血管用Hanks液反複洗淨血汙後放人含培養液平皿中 。

3．將洗淨動脈切成2．5～3．0cm長的小段並剝離外膜 。用兩個鑷子在動脈段的一端撕開外膜 ，用組織鑷夾住中膜 ，用帶鉤鑷子夾住外膜向另一端撕拉 ，使外膜呈現套袖狀剝下 。

4．剪取鑷子夾過的中膜 ，將動脈縱行剪開 ，使內膜朝上平攤於小木塊上 ，以圓鈍的鑷子或剪刀背輕輕刮去內皮細胞 。

5．將剝去內 、外膜的中膜在培養液中洗淨 ，平鋪在另一小木塊上 ，用刀片切成1mm3大小的組織塊 ，即為平滑肌組織 。

(二)分散細胞與原代培養

1．將動脈中層組織塊置於小三角燒瓶(或小瓶)中 ，加入O．2％膠原酶溶液 ，蓋上蓋 ，在37℃恒溫箱中作用1～3h ，至組織呈絮狀 。

2．再加入O．15％溶液 ，於37℃磁力攪拌下消化5～10min 。吸取分散的細胞 ，即為平滑肌細胞 。如還有組織塊 ，可用溶液再消化1次 。

3．將所得的全部懸液吸入刻度離心管中 ，加含10％小牛血清的培養液以終止消化 。1000～1500r／min離心5min ，棄去上清液 。

4．將細胞沉澱加入含20％小牛血清的培養液中 ，調製成濃度為l～5×105個／ml的細胞懸液 ，接種於培養瓶中 。

5．37℃ 、C02培養箱中培養 ，逐日觀察 ，每3d換液1次 。

(三)傳代細胞培養

    當原代細胞生長至融合並形成單層細胞時即可傳代培養 。

1．傾去培養液 ，以Hanks液洗滌瓶壁上的細胞2次 。

2．加入O．15％與0．02％EDTA混合消化液 ，覆蓋細胞表麵即可 。室溫下作用2min並用倒置(或相差)顯微鏡觀察 ，可見大部分細胞變圓 ，邊緣清楚 ，此時翻轉培養瓶停止消化 。

3．倒去消化液 ，加入含10%小牛血清的培養液以終止消化 。用吸管吹打(或用帶膠皮的彎頭滴管將細胞從瓶壁上刮下再吹打)分散細胞 ，製成細胞懸液。調製細胞濃度為l～5×105個／ml 。

4．接種到新的培養瓶中 ，並補充含10％小牛血清的培養液進行培養 。細胞長滿成層後 ，又可依同法傳代 。

(四)細胞同步培養法

    當常規培養的平滑肌細胞轉入低血清培養液中培養2～3d後 ，細胞大多能停留在細胞周期的G0期 ，基本達到同步化效果。具體方法 ：

1．傾去常規培養的培養液 ，並用Hanks液洗滌3次 。

2．加入含O．5％小牛血清的培養液 ，於37℃下維持培養2～3d ，可使細胞基本上同步於G0期 。

3．當轉入含10％血清培養液中培養12h時 ，平滑肌細胞會再次同步進入DNA合成期 。

(五)平滑肌細胞玻片培養法

    將小方瓶(或培養皿)內預先放人蓋玻片 ，將平滑肌懸液接種其上 ，待生長成單層細胞後取出蓋玻片 ，用於染色 、製電鏡標本等 。

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