1．免疫染色可在塗片或組織切片上進行免疫染色 。首先 ，標記抗體與標本中抗原反應結合 。其次 ，用PBS吸取未結合成分 。zui後 ，直接觀察結果(免疫熒光直接法)或顯色後再用顯微鏡觀察(免疫酶直接法) 。在此基礎上發展出間接法 、多層法 ，雙標記法等各種方法 。在免疫染色中應特別注意增強特異性染色 ，減少或消除非特異性染色 。在各種免疫染色中都應注意以下幾個問題 ：

(1)增強特異性染色方法

1)蛋白酶消化法 ：目的是暴露抗原 ，增加細胞和組織通透性 ，使抗原抗體zui大限度結合 ，增強特異性染色和避免非特異性染色 。該法已廣泛用於各種免疫細胞化學染色 。常用蛋白酶有 、及等 ；酶消化時間和溫度因各種抗原對消化的敏感性不同 ，應根據酶活性通過預實驗確定 ，消化時間還與組織固定的時間有關 ，越陳舊固定組織所需時間越長 ，以37℃為宜 。

2)適宜的抗體稀釋度 ：抗體濃度是免疫染色關鍵步驟 。濃度過高 ，抗體分子多於抗原決定簇 ，可導致抗體結合減少 ，產生陰性結果 。

3)溫育時間 ：一般抗體溫育時間為30～60min ，必要時可4℃過夜 。溫育溫度常用37℃ ，也可在室溫中進行 。37℃可增強抗原抗體反應 ，適用於多數抗原染色 ，但應注意在濕盒中進行 ，防止切片幹燥而導致失敗 。

4)多層染色法 ：對弱抗原可用直接法(雙層) 、辣根過氧化物酶一抗過氧化物酶(PAP)和抗一(ABC)法(j層) ，四層或五層PAP法或ABC法 ，或PAP和ABC聯合染色法等，可很大程度提高敏感性 ，獲得良好結果 。

5)其他增敏方法 ：如微波處理法 、酪氨酰胺信號放大技術(tyramide signal smplmcation ，TSA)增敏方法以及免疫PcR方法等 。

(2)減少或消除非特異性染色的方法 ：組織中，非抗原抗體出現的陽性染色稱為非特異性背景染色 ，zui常見原因是蛋白吸附於高電荷的膠原和結締組織成分上 。有效消除方法是在用*抗體前，加與製備*抗體相同的動物的非免疫血清(1 ：20～l ：5) ，封閉組織上帶電基團而除去與*抗體非特異性結合 。必要時加入2％～5％牛血清白蛋白 ，可進一步減少非特異性染色 ，作用時間為lO～20min 。

(3)顯色反應的控製 ：免疫酶染色應注意 ：1)成色質濃度和反應時間 。增加成色質的量和(或)增加底物反應時間 ，可增加反應產物強度 ，著色太深可減少反應時間 。2)過氧化物酶顯色時 ，H2O2濃度較大將使顯色反應過快而導致背景加深 ，過量H2O2可抑製酶活性 。

(4)複染 ：根據所用實驗方法和呈現顏色不同 ，可選用適當複染方法 。如陽性結果呈紅色或棕色 ，則用蘇木素將核染成藍色 ，以便定位檢測 。

4．對照設對照目的在於tiEBIj陽性結果的特異性 ，排除非特異性結果 。主要針對*抗體對照 ，常用對照方法包括 ：陽性對照 、陰性對照 、阻斷試驗 、替代對照 、空白對照 、自身對照和吸收試驗 。

5．免疫細胞化學結果判斷對免疫細胞化學結果判斷應注意幾點 ：①準確判斷陽性和陰性 ，排除假陽性和假陰性結果 ，必須嚴格對照試驗 ，對新發現陽性結果 ，除有對照試驗結果之外 ，應進行多次重複試驗 ，並用幾種方法進行驗證 。②判定特異性染色和非特異性染色 ：特異性反應產物常分布於特定部位 ，且在同一切片上呈現不同程度陽性染色結果 。而非特異性染色表現為無一定的分布規律 ，常呈某一部位成片的均勻著色 ，和周圍結締組織均無區別著色 ，或結締組織呈現很強的染色 ；常出現於幹燥切片邊緣 ，有由於過強刀痕或自製折疊的部位 ；在過大組織塊 ，中心固定不好也會造成非特異染色 。當非特異性染色和特異性染色同時存在時 ，過強的非特異性染色背景會影響對特異性染色結果的觀察和記錄 。

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