老哥俱乐部

实验报告
：

一、分离与培养：

1、无菌条件下
，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织
，然后用PBS将此组织块清洗2次，将组织剪成1mm3左右大小；

2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶）
，混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清
，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液

，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织被消化；

4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液
，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养
；

5
、差速贴壁1h后
，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养
；二、免疫荧光鉴定：

1
、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次
，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS冲洗细胞2次，每次10min


，然后在室温条件下
，用4% BSA封闭细胞30min
；

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；

5、PBS冲洗细胞3次
，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；

6、用PBS冲洗3次
，每次10min，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

细胞简介
：

小鼠气管上皮分离自气管组织；气管（Trachea）

，呼吸器官的一部分
；为后壁略平的圆筒型管状。上端平第六颈椎下缘，与环状软骨相连；向下至第四
、五胸椎体（相当胸骨角平面）交界处，分左、右主支气管
，分叉处称为气管杈
。气管主要由14-16个半环状软骨构成
，有弹性，软骨为“C"字形的软骨环，缺口向后，各软骨环以韧带连接起来，环后方缺口处由平滑肌和致密结缔组织连接，保持了持续张开状态。管腔衬以粘膜，表面覆盖纤毛上皮，粘膜分泌的粘液可粘附吸入空气中的灰尘颗粒，纤毛不断向咽部摆动将粘液与灰尘排出，以净化吸入的气体。气管上皮是气道与外界环境接触的道防线，不仅是各种病原体、炎症介质作用的靶细胞，还作为效应细胞合成
、释放多种炎性介质和细胞因子从而参与气道炎症及免疫反应
。体外培养的原代气管上皮细胞因与体内组织在形态结构和功能活动上存在很大的相似性，因此，在基础及临床研究中极为重要。

方法简介：

公司实验室分离的小鼠气管上皮采用-混合消化法结合差速贴壁法
，并通过上皮细胞专用培养基培养筛选制备而来
，细胞总量约为5×10?cells/瓶
。

质量检测

公司实验室分离的小鼠气管上皮经PCK免疫荧光鉴定
，纯度可达90%以上
，且不含有HIV-1
、HBV
、HCV、支原体、细菌
、酵母和真菌等
。

培养信息
：

包被条件 鼠尾胶原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培养基 含FBS、生长添加剂
、Penicillin、Streptomycin等

换液频率 每2-3天换液一次

生长特性 贴壁

细胞形态 上皮细胞样

传代特性 可传1-2代

消化液 0.25%

培养条件 气相
：空气，95%；CO2，5%

注意事项：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好
，培养液是否有漏液、浑浊等现象
，若有上述现象发生请及时和老哥俱乐部联系。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息
，如细胞形态、所用培养基
、血清比例
、所需细胞因子等
，确保细胞培养条件一致
，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题
，责任由客户自行承担。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态。因运输问题
，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片，是正常现象。观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h。

4. 贴壁细胞可以消化
，悬浮细胞直接混匀收集细胞，900 rpm-1000 rpm离心3 min，弃上清。加5 mL PBS重悬细胞，再900 rpm-1000 rpm离心3 min，
，用新鲜的*培养基重悬细胞，并接种到新的培养瓶或培养皿中，置于培养箱中进行培养。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流。由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和老哥俱乐部联系，告知细胞的具体情况，以便老哥俱乐部的技术人员跟踪回访直至问题解决
。

7. 该细胞仅供科研使用
。

8. 备注

：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞。收到细胞后次传代建议1：2传代 。

9.注意： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿
。不是1个T25瓶传2个10cm皿
。

公司正在出售的产品：

血管紧张素转化酶   英文名称：   Angiotensin Conveing Enzyme   规格：      英文缩写：   ACE

膜联蛋白2   英文名称：   Annexin 2   规格：      英文缩写：   ANXA-2

骨碱性0酸酶   英文名称
：   bone alkaline phosphatase   规格：      英文缩写：   BALP

凋亡因子BAX   英文名称：   apoptogen BAX   规格：      英文缩写：   BAX

小鼠抑制素A(INH-A)ELISA 试剂盒 96T/48T

Human granulysin (granulysin) ELISA Kit 人颗粒溶素(granulysin)试剂盒

HumanGasinELISAKit 人胃泌素(Gasin)试剂盒 96T/48T 进口分装

CLIAKitfor6-K-PGELISAKit大鼠6同前列腺素

饮料D-苹果酸比色法定量试剂盒20次

MousemammarycarcinomaMarker-CA153ELISAKit小鼠癌标志物-CA153试剂盒规格：96T/48T

CPM重组小鼠 Carboxypeptidase M / CPM 蛋白 Protein

β-血小板球蛋白(βTG)重组蛋白 Recombinant Beta-Thromboglobulin (bTG)

PRTFDC1重组人 PRTFDC1 蛋白 Protein

CCL7 Protein Human 重组人 MCP-3 / CCL7 蛋白

CD63 Protein Cynomolgus 重组食蟹猴 CD63 / Tspan-30 / Tetraspanin-30 蛋白

肝脂酶(LIPC)重组蛋白 Recombinant Lipase, Hepatic (LIPC)

CCL7 Protein Human 重组人 MCP-3 / CCL7 蛋白

BGN重组小鼠 Biglycan / PG-S1 / BGN 蛋白 (Fc 标签) Protein

THPO Protein Cynomolgus 重组食蟹猴 Thrombopoietin / THPO / TPO 蛋白

PDHA1重组人 PDHA1 / C54G1 蛋白1 (aa 30-390) Protein

小鼠气管上皮细胞大鼠复制蛋白A 70kDaDNA结合亚基(RPA1)试剂盒
，英文名
： RPA1 ELISA Kit

Porcine methemoglobin (MHB) ELISA Kit 猪高铁血红蛋白(MHB)试剂盒

转基因植物Sad1基因核酸试剂盒 48T

CLIAKitforMBP(Mousemyelinbasicprotein)ELISAKit小鼠髓0脂碱性蛋白

体液氧化型(GSSG)浓度比色法定量试剂盒50次

ELISAKitLp-PL-A2脂蛋脂酶A2