老哥俱乐部

实验报告
：

一、分离与培养：

1、无菌条件下
，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织
，然后用PBS将此组织块清洗2次
，将组织剪成1mm3左右大小；

2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min
，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清
，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

3

、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s
，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次
，直至组织被消化；

4

、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液
，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；

5
、差速贴壁1h后

，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；二、免疫荧光鉴定：

1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

2、PBS冲洗细胞2次

，每次10min
，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS冲洗细胞2次
，每次10min，然后在室温条件下
，用4% BSA封闭细胞30min

；

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗
，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；

5、PBS冲洗细胞3次

，每次10min，按1
：150的比例稀释抗α-actin的二抗
， 37℃条件下放置1h
；

6
、用PBS冲洗3次，每次10min，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

细胞简介
：

小鼠口腔粘膜成纤维分离自口腔粘膜组织

；口腔（oral cavity）是消化道的起始部分
。前借口裂与外界相通，后经咽峡与咽相续。口腔内有牙
、舌等器官。口腔的前壁为唇
、侧壁为颊、顶为腭

、口腔底为黏膜和肌等结构
。口腔借上、下牙弓分为前外侧部的口腔前庭（oral vestibule）和后内侧部的固有口腔（oral cavity proper）；当上、下颌牙咬合时
，口腔前庭与固有口腔之间可借第三磨牙后方的间隙相通
。成纤维细胞（Fibroblast）是疏松结缔组织的主要细胞成分
，由胚胎时期的间充质细胞分化而来。成纤维细胞较大，轮廓清楚，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构

，其细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显。成纤维细胞功能活动旺盛
，细胞质嗜弱碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动
，在一定条件下
，它可以实现跟纤维细胞的互相转化；成纤维细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损的修复有着十分重要的作用
。刚分离的表皮成纤维细胞呈圆形、折光性良好，悬浮于培养基中。30min细胞贴壁，其中部分开始伸出伪足，表现为小的突起；6h后细胞基本贴壁
，伸展成梭形，胞核清晰，分布较均匀

，散在生长，不聚集成团；细胞生长迅速，5-7天即呈融合状态
，细胞排列紧密
，有的交叉重叠生长

，平坦、胞体较大，细胞质透明
，细胞核较大
，呈椭圆形，颜色淡。细胞融合，并彼此连接成网状；细胞呈突起的纺锤形或星形的扁平分布

。

方法简介：

公司实验室分离的小鼠口腔粘膜成纤维采用-胶原酶混合酶消化后差速贴壁制备而来，细胞总量约为5×10?cells/瓶。

质量检测

公司实验室分离的小鼠口腔粘膜成纤维经Vimentin免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养信息

：

培养基 含FBS
、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等

换液频率 每2-3天换液一次

生长特性 贴壁

细胞形态 成纤维细胞样

传代特性 可传1-2代

消化液 0.25%

培养条件 气相

：空气

，95%；CO2，5%

注意事项：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和老哥俱乐部联系。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基
、血清比例、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面

，显微镜下观察细胞状态。因运输问题
，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片，是正常现象
。观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h。

4. 贴壁细胞可以消化，悬浮细胞直接混匀收集细胞，900 rpm-1000 rpm离心3 min，弃上清。加5 mL PBS重悬细胞
，再900 rpm-1000 rpm离心3 min
，，用新鲜的*培养基重悬细胞，并接种到新的培养瓶或培养皿中
，置于培养箱中进行培养
。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片
，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流
。由于运输的原因
，个别敏感细胞会出现不稳定的情况

，请及时和老哥俱乐部联系，告知细胞的具体情况，以便老哥俱乐部的技术人员跟踪回访直至问题解决。

7. 该细胞仅供科研使用。

8. 备注：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞。收到细胞后次传代建议1
：2传代 。

9.注意： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿。不是1个T25瓶传2个10cm皿。

公司正在出售的产品：

大鼠Kelch样ECH相关蛋白1(KEAP1)检测试剂盒
，英文名： KEAP1 ELISA Kit

Mouse pulmonary surfatca associated protein A (SP-A) ELISA Kit 小鼠肺表面活性物质相关蛋白A(SP-A)检测试剂盒

ELISA 小鼠组织多肽抗原(mouse TPA)  进口分装

CLIAKitforICAM-3/CD50(Humaniercellularadhesionmolecule3)ELISAKit人细胞间粘附分子3

通用型十字花科蔬菜黑腐病菌(Xahomonascampesispv.armoraciae;Xcarm)试剂盒20次

ELISAKitCA大鼠酶

CD19重组小鼠 CD19 / Leu-12 蛋白 Protein

AR Alpha1( Alpha1-adrenergic receptor 0.5mgAR Alpha1( Alpha1-adrenergic receptor) α1能受体抗原

ERBB4重组人 / 恒河猴 HER4 / ErbB4 蛋白 Protein

CSTB Protein Human 重组人 Cystatin B / CSTB 蛋白

VEGFC Protein Rat 重组大鼠 VEGFC / VEGF-C 蛋白 (aa 108-223, His 标签)

AR Alpha1( Alpha1-adrenergic receptor 0.5mgAR Alpha1( Alpha1-adrenergic receptor) α1能受体抗原

CSTB Protein Human 重组人 Cystatin B / CSTB 蛋白

CD19重组小鼠 CD19 / Leu-12 蛋白 Protein

VEGFC Protein Rat 重组大鼠 VEGFC / VEGF-C 蛋白 (aa 108-223, His 标签)

ERBB4重组人 / 恒河猴 HER4 / ErbB4 蛋白 Protein

小鼠内毒素(ET)ELISA 试剂盒 96T/48T

P Nixonn Ron (Prednisolone) ELISA Kit 人龙(Prednisolone)检测试剂盒

Human26Sproteasome,26SPSMELISAKit 人26S蛋白酶体(26SPSM)检测试剂盒 96T/48T 进口分装

HumanAbnormalprothrombin,APT检测试剂盒人异常原(APT)检测试剂盒规格：96T/48T

正常女性人体肝组织微粒体组分(5毫克/毫升)500微升

Mouseaidiuretichormone/vasopressin/argininevasopressin,ADH/VP/AVPELISAKit小鼠抗利尿激素/血管加压素/精加压素(ADH/VP/AVP)检测试剂盒规格
：96T/48T

小鼠口腔粘膜成纤维细胞小鼠抗透明带抗体检测试剂盒   小鼠抗透明带抗体试剂盒   规格型号：96T/48T   小鼠抗透明带抗体试剂盒，规格型号：96T/48T
，来源：检测试剂盒（进口分装）
，产品别名：小鼠抗透明带抗体试剂盒、小鼠抗透明带抗体eisa试剂盒   保存条件：2-8℃   保质期：6个月。

小鼠抗平滑肌抗体检测试剂盒   小鼠抗平滑肌抗体试剂盒   规格型号：96T/48T   小鼠抗平滑肌抗体试剂盒，规格型号：96T/48T，来源：检测试剂盒（进口分装）

，产品别名：小鼠抗平滑肌抗体试剂盒、小鼠抗平滑肌抗体eisa试剂盒   保存条件
：2-8℃   保质期
：6个月。

小鼠抗受体检测试剂盒   小鼠抗受体试剂盒   规格型号：96T/48T   小鼠抗受体试剂盒
，规格型号：96T/48T
，来源：检测试剂盒（进口分装），产品别名：小鼠抗受体试剂盒
、小鼠抗受体eisa试剂盒   保存条件：2-8℃   保质期：6个月

。

小鼠抗Ⅲ抗体检测试剂盒   小鼠抗Ⅲ抗体试剂盒   规格型号
：96T/48T   小鼠抗Ⅲ抗体试剂盒，规格型号

：96T/48T
，来源：检测试剂盒（进口分装），产品别名：小鼠抗Ⅲ抗体试剂盒、小鼠抗Ⅲ抗体eisa试剂盒   保存条件

：2-8℃   保质期：6个月。