老哥俱乐部

实验报告
：

一
、分离与培养：

1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织
，然后用PBS将此组织块清洗2次
，将组织剪成1mm3左右大小
；

2

、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶），混悬10s
，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置
；

3

、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置

，重复此步骤2-3次，直至组织被消化；

4
、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬
，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养
；

5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；二、免疫荧光鉴定：

1
、待心房肌细胞生长至80%融合时
，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次
，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min
；

2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下
，用0.1％Triton X-100透膜15min
；

3、PBS冲洗细胞2次

，每次10min，然后在室温条件下
，用4% BSA封闭细胞30min；

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；

5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1
：150的比例稀释抗α-actin的二抗
， 37℃条件下放置1h；

6、用PBS冲洗3次，每次10min，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

细胞简介：

小鼠骨髓树突状分离自骨髓；骨髓是机体的造血组织
，位于身体的许多骨骼内。成年动物的骨髓分两种：红骨髓和黄骨髓。红骨髓能制造红细胞、血小板和各种白细胞。血小板有止血作用，白细胞能杀灭与抑制各种病原体，包括细菌
、病毒等
；某些淋巴细胞能制造抗体。因此

，骨髓不但是造血器官
，它还是重要的免疫器官。骨髓是存在于长骨(如肱骨、股骨)的骨髓腔和扁平骨(如髂骨)的稀松骨质间的网眼中，是一种海绵状的组织，能产生血细胞的骨髓略呈红色，称为红骨髓

。出生时，红骨髓充满全身骨髓腔
，随着年龄增大
，脂肪细胞增多，相当部分红骨髓被黄骨髓取代，后几乎只有扁平骨骨髓腔中有红骨髓
。骨髓DC细胞是由骨髓单核细胞诱导而成的；树突状细胞分为成熟树突状细胞和未成熟树突状细胞

，典型的未成熟树突状细胞呈半贴壁生长
，在GM-CSF、IL4的作用下形成葡萄串样集落
，细胞大而形态不规则，表面皱褶多，亦可见少量短刺状突，胞内细胞器丰富并可见吞噬泡，具有较强的迁移能力，伴随有部分未诱导成的单核细胞


，贴壁形态多样。而成熟的树突状细胞由未成熟DC进一步经TNFα、LPS等诱导而成，多数呈悬浮生长
， 细胞呈圆形，细胞体积进一步增大
，表面大量粗细不等的树枝样突起(高倍镜或者电镜下可观察到 )，伴随少量贴壁未成熟细胞或者单核细胞
。未成熟DC细胞长时间培养也可能导致自发分化成熟
。DC细胞尚无特异性细胞表面分子标志，主要通过形态学、组合性细胞表面标志、在混合淋巴细胞反应中能激活初始T细胞等特征进行鉴定。其中成熟树突状细胞表面高表达主要组织相容性复合物(MHC)以及CD80、CD86等共刺激分子
，进而激活T淋巴细胞，诱导免疫应答，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节；未成熟树突状细胞具有很强的抗原摄取加工能力
，但由于缺乏多种共刺激分子不能使初始T细胞活化、增殖产生免疫应答，不能激活T细胞的信号
，可导致T细胞无能
，从而诱导免疫低反应或抗原免疫特异性耐受
。未成熟树突状细胞表面CD80、CD86
、MHC-Ⅱ类分子等共刺激分子表达较低，一般在30%以下
。

方法简介
：

实验室分离的小鼠骨髓成熟DC采用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞、培养过程添加细胞因子诱导而来
，细胞总量约为5×10⁵cells/瓶
。

质量检测

实验室分离的小鼠骨髓树突状(成熟DC细胞)经CD86免疫荧光鉴定、细 胞 形态等综合鉴定，纯度可达80%以上，且不含有HIV-1

、HBV、HCV

、支原体
、细菌、酵母和真菌等
。

培养信息：

培养基：含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等

换液频率

：每2-3天换液一次

生长特性：半贴壁半悬浮

细胞形态
：圆形，树突状

传代特性
：属于高度分化细胞

；属于不增殖细胞群

消化液：0.25%

培养条件
：气相：空气

，95%；CO2，5%

小鼠骨髓树突状(成熟DC细胞)体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养
，以此保证该细胞的佳培养状态
。

注意事项
：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液
、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和老哥俱乐部联系。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态

、所用培养基
、血清比例
、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担

。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态。因运输问题，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片，是正常现象
。观察好细胞状态后
，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h。

4. 贴壁细胞可以消化
，悬浮细胞直接混匀收集细胞

，900 rpm-1000 rpm离心3 min，弃上清
。加5 mL PBS重悬细胞，再900 rpm-1000 rpm离心3 min，
，用新鲜的*培养基重悬细胞，并接种到新的培养瓶或培养皿中，置于培养箱中进行培养。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养
。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片
，记录细胞状态

，便于和我司技术部沟通交流

。由于运输的原因
，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和老哥俱乐部联系，告知细胞的具体情况，以便老哥俱乐部的技术人员跟踪回访直至问题解决
。

7. 该细胞仅供科研使用
。

8. 备注：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞

，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞。收到细胞后次传代建议1：2传代 。

9.注意： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿。不是1个T25瓶传2个10cm皿
。

公司正在出售的产品：

大鼠中性粒细胞明胶酶关联脂质运载蛋白(NGAL)检测试剂盒 ，英文名： NGAL ELISA Kit

Mouse soluble cell differeiation aigen 40 Ligand (sCD40L) ELISA Kit 小鼠可溶性白细胞分化抗原40配体(sCD40L)检测试剂盒

MouseFactor-relatedApoptosisligand,FASLELISAKit 小鼠凋亡相关因子配体(FASL)检测试剂盒 96T/48T 进口分装

CLIAKitforHumanHypotheticalproteinLOC677168ELISAKit人假定蛋白LOC677168

B12比色法定量检测试剂盒20次

ELISAKitHpt/HP大鼠结合珠蛋白/触珠蛋白

PTPRC重组小鼠 CD45 / PTPRC 蛋白 (aa 453-1152, His & GST 标签) Protein

钙结合蛋白(CR)重组蛋白 Recombinant Calretinin (CR)

CRIPT重组人 CRIPT / cysteine-rich PDZ-binding 蛋白 Protein

CSNK1A1 Protein Human 重组人 CSNK1A1 / CKI-alpha / CK1 蛋白 (GST 标签)

IL13 Protein Cynomolgus 重组食蟹猴 IL13 / ALRH 蛋白

UL16结合蛋白2(ULBP2)重组蛋白 Recombinant UL16 Binding Brotein 2 (ULBP2)

CSNK1A1 Protein Human 重组人 CSNK1A1 / CKI-alpha / CK1 蛋白 (GST 标签)

CD84重组小鼠 CD84 蛋白 Protein

EPCAM Protein Cynomolgus 重组食蟹猴 / 恒河猴 EpCAM / TROP-1 / TACSTD1 蛋白 (Fc 标签)

EPHA3重组人 EphA3 蛋白 Protein

小鼠Ⅷ相关抗原(FⅧ-Ag)ELISA 试剂盒 96T/48T

Human coagulation factor IX (F IX) ELISA Kit 人Ⅸ(FⅨ)检测试剂盒

Humanlowmolecular-weightprotein/proteasomebeta-typesubunit,LMP7/PSMB9ELISAKit 人低分子质量蛋白7/β型蛋白酶体9(LMP7/PSMB9)检测试剂盒 96T/48T 进口分装

Human17-Hydroxyprogesterone,17-OHP检测试剂盒人17羟孕同(17-OHP)检测试剂盒规格
：96T/48T

真菌/酵母细胞线粒体损伤/氧化(NAO)荧光测定试剂盒20/200次

MouseAquaporin0,AQP-0ELISAKit小鼠水通道蛋白0(AQP-0)检测试剂盒规格：96T/48T

小鼠骨髓树突状细胞(成熟DC细胞)小鼠可溶性坏死因子-α受体   英文名称：   soluble tumor necrosis factor receptor 1   规格：      英文缩写：   Stnf-αR

小鼠组织多肽抗原   英文名称：   Tissue Polypeptide Aigen   规格：      英文缩写
：   TPA

小鼠血小板生成素   英文名称：   Thromboietin   规格：      英文缩写

：   TPO

小鼠坏死因子相关凋亡诱导配体   英文名称：   tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand   规格：      英文缩写：   AIL/APO 2L