實驗報告 ：

一 、分離與培養 ：

1 、無菌條件下 ，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織 ，然後用PBS將此組織塊清洗2次，將組織剪成1mm3左右大小 ；

2 、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s ，置37℃條件下消化10min ，之後用滴管吹打製成單細胞懸液 ，自然沉澱並收集上清 ，用含10% FBS培養基終止消化後4℃放置 ；

3 、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液 ，混懸10s ，置37℃消化10 min後 ，按上述方法收集上清並終止消化後4℃放置 ，重複此步驟2-3次 ，直至組織被消化；

4 、用200目不鏽鋼篩網過濾細胞消化液 ，1200r/min 離心10min ，棄去上清 ，沉澱細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養基混懸 ，接種於25cm2培養瓶 ，放置於37℃  ，5％CO2 培養箱中培養 ；

5 、差速貼壁1h後，吸出培養基 ，按實驗需要接種於6孔板中繼續培養 ；二、免疫熒光鑒定 ：

1 、待心房肌細胞生長至80%融合時 ，棄去培養基 ，用溫育的PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min ；

2 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在4℃條件下 ，用0.1％Triton X-100透膜15min ；

3 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在室溫條件下 ，用4% BSA封閉細胞30min ；

4 、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗 ，然後將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜 ；

5 、PBS衝洗細胞3次 ，每次10min ，按1 ：150的比例稀釋抗α-actin的二抗 ， 37℃條件下放置1h ；

6 、用PBS衝洗3次 ，每次10min ，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像並拍照 。

細胞簡介 ：

兔神經幹分離自腦皮層組織 ；大腦分左右兩個半球 ，大腦皮質（灰質）覆蓋著每個大腦半球的大部分 ，它是神經元胞體集中的地方 。內部則是由神經纖維或髓鞘構成的白質 。每一個半球都有三個麵 ，即外側麵（約占整個皮質麵積的1/3） 、內側麵和底麵（占2/3的麵積） ；半球表麵有很多深淺不等的溝或裂 ，溝或裂之間的隆起叫回 ，它們大大增加了大腦的表麵積 ；大腦外側麵重要的溝 、裂有大腦外側裂 、頂枕裂和中央溝 。由於三溝裂之界隔 ，使大腦皮質組分為額葉 、頂葉 、顳葉 、枕葉四大部分 。神經幹細胞具有分化為神經神經元 、星形膠質細胞和少突膠質細胞的能力 ，能自我更新 ，並足以提供大量腦組織細胞的細胞群 。神經幹細胞是一類具有分裂潛能和自更新能力的母細胞 ，它可以通過不對等的分裂方式產生神經組織的各類細胞 。需要強調的是 ，在腦脊髓等所有神經組織中 ，不同的神經幹細胞類型產生的子代細胞種類不同 ，分布也不同 。神經幹細胞作為幹細胞的一種 ，它具有其它所有幹細胞的基本特征 ：具有自我維持和自我更新能力 ，具有多種分化潛能 ，具有分化為本係統大部分類型細胞的能力 ，這種自我更新和分化潛能可以維持相當長的時間甚至終生 ，對損傷和疾病具有反應能力 。神經幹細胞在疾病 、損傷狀態下具有增殖 、遷移 ，並向神經細胞 、星形膠質細胞和少突膠質細胞分化的能力 ，已成為神經係統損傷修複和再生研究的熱點 ，體外建立穩定的神經幹細胞培養模型是其基礎和臨床應用的前提 。神經幹細胞在培養3-4d後 ，可形成神經球 ，神經球在培養基中呈懸浮生長，予以更換半量培基 ，1周後用吸管輕柔吹打球形克隆成為小的神經球和單細胞懸液 ，將部分細胞接種到新的培養瓶中 ，2×105個細胞/瓶 ，每7-10d傳代1次 ，每隔3d離心更換半量培養基1次 ，培養條件不變。

方法簡介 ：

實驗室分離的兔神經幹采用消化後差速貼壁 ，結合神經幹細胞專用培養基培養篩選製備而來 ，總量約為5×10⁵cells/瓶 。

質量檢測

實驗室分離的兔神經幹經Nestin免疫熒光鑒定 ，純度可達90%以上 ，且不含有HIV-1 、HBV 、HCV 、支原體 、細菌 、酵母和真菌等 。

培養信息 ：

培養基 ：含B-27 Supplement 、EGF 、bFGF 、Penicillin 、Streptomycin等

換液頻率 ：每2-3天換液一次

生長特性 ：懸浮

細胞形態 ：球形

傳代特性 ：可傳2-3代

消化液 ：0.25% ，Accutase

培養條件 ：氣相 ：空氣 ，95% ；CO2 ，5%

兔神經幹體外培養周期有限 ；建議使用配套的專用生長培養基及正確的操作方法來培養 ，以此保證該細胞的佳培養狀態 。

注意事項 ：

1. 收到細胞後首先觀察細胞瓶是否完好 ，培養液是否有漏液 、渾濁等現象 ，若有上述現象發生請及時和老哥俱樂部聯係 。

2. 仔細閱讀細胞說明書 ，了解細胞相關信息 ，如細胞形態 、所用培養基 、血清比例 、所需細胞因子等 ，確保細胞培養條件一致 ，若由於培養條件不一致而導致細胞出現問題 ，責任由客戶自行承擔 。

3. 用75%酒精擦拭細胞瓶表麵 ，顯微鏡下觀察細胞狀態 。因運輸問題 ，部分細胞由於溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片 ，是正常現象 。觀察好細胞狀態後 ，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置於37℃培養箱放置4-6h 。

4. 貼壁細胞可以消化 ，懸浮細胞直接混勻收集細胞 ，900 rpm-1000 rpm離心3 min ，棄上清 。加5 mL PBS重懸細胞 ，再900 rpm-1000 rpm離心3 min ， ，用新鮮的*培養基重懸細胞 ，並接種到新的培養瓶或培養皿中 ，置於培養箱中進行培養 。

5. 請客戶用相同條件的培養基用於細胞培養 。

6. 建議客戶收到細胞後前3天各拍幾張細胞照片 ，記錄細胞狀態 ，便於和我司技術部溝通交流 。由於運輸的原因 ，個別敏感細胞會出現不穩定的情況 ，請及時和老哥俱樂部聯係 ，告知細胞的具體情況 ，以便老哥俱樂部的技術人員跟蹤回訪直至問題解決 。

7. 該細胞僅供科研使用 。

8. 備注 ：運輸用的培養基(灌液培養基)不能再用來培養細胞 ，請換用按照說明書細胞培養條件新配製的*培養基來培養細胞 。收到細胞後次傳代建議1 ：2傳代  。

9.注意 ： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿 。不是1個T25瓶傳2個10cm皿 。

公司正在出售的產品 ：

小鼠C-肽   英文名稱 ：   C-peptide   規格 ：      英文縮寫 ：   C-peptide

小鼠心肌肌鈣蛋白   英文名稱 ：   cardiac oponin 1   規格 ：      英文縮寫 ：   cTn1

小鼠粒細胞集落刺激因子   英文名稱 ：   granulocyte colony-stimulating factor   規格 ：      英文縮寫 ：   G-CSF

小鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子   英文名稱 ：   granulocyte-macrophage colony-stimulating factor   規格 ：      英文縮寫 ：   GM-CSF

小鼠穀酸脫羧酶自身抗體(GAD-Ab)ELISA 試劑盒 96T/48T

Human retinoblastoma tumor suppressor protein (pRB) ELISA Kit 人視網膜母細胞瘤抑製蛋白(pRB)試劑盒

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PAR-2 OP(Protease-activated receptors-2 Activating Orange-peptide 0.5mgPAR-2 OP(Protease-activated receptors-2 Activating Orange-peptide) 蛋白酶激活受體-2桔抗肽

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FASLG Protein Human 重組人 Fas Ligand / FASLG / CD95L 蛋白

CD80 Protein Human 重組人 CD80 / B7-1 蛋白

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兔神經幹細胞大鼠巨嗜細胞趨化蛋白1(MCP-1/CCL2/MCAF)試劑盒  ，英文名 ： MCP-1/CCL2/MCAF ELISA Kit

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Mousephospho-exacellularsignal-regulatedkinase,pERKELISAKit 小鼠0酸化細胞外信號調節激酶(pERK)試劑盒 96T/48T 進口分裝

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同位素標記放射活性TCA試劑盒20次

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