老哥俱乐部

实验报告
：

一、分离与培养：

1、无菌条件下

，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织

，然后用PBS将此组织块清洗2次，将组织剪成1mm3左右大小；

2
、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶），混悬10s
，置37℃条件下消化10min
，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液
，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置
，重复此步骤2-3次，直至组织被消化；

4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬
，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；

5
、差速贴壁1h后，吸出培养基

，按实验需要接种于6孔板中继续培养；二、免疫荧光鉴定
：

1
、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基
，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

2
、PBS冲洗细胞2次
，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS冲洗细胞2次，每次10min
，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min
；

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜
；

5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1
：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；

6、用PBS冲洗3次，每次10min
，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

细胞简介
：

兔胚肺成纤维分离自胚肺组织；肺是机体的呼吸器官

，位于胸腔，左右各一，覆盖于心之上
。肺有分叶，左二右三，共五叶。肺经肺系（指气管、支气管等）与喉、鼻相连，故称喉为肺之门户，鼻为肺之外窍
。成纤维细胞（Fibroblast）是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞分化而来。成纤维细胞较大
，轮廓清楚，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构
，其细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显
。成纤维细胞功能活动旺盛
，细胞质嗜弱碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动，在一定条件下，它可以实现跟纤维细胞的互相转化
；成纤维细胞对不同程度的细胞变性
、坏死和组织缺损的修复有着十分重要的作用
。刚分离的胚肺成纤维细胞呈圆形

、折光性良好，悬浮于培养基中
。30min细胞贴壁
，其中部分开始伸出伪足，表现为小的突起；6h后细胞基本贴壁，伸展成梭形，胞核清晰
，分布较均匀
，散在生长

，不聚集成团
；细胞生长迅速，5-7天即呈融合状态，细胞排列紧密，有的交叉重叠生长，平坦、胞体较大，细胞质透明，细胞核较大，呈椭圆形
，颜色淡
。细胞融合，并彼此连接成网状；细胞呈突起的纺锤形或星形的扁平分布
。细胞呈突起的纺锤形或星形的扁平分布
。该细胞在合成和分泌细胞因子、维持血管内外和凝血和纤溶的的动态平衡中起重要作用。

方法简介：

实验室分离的兔胚肺成纤维采用-胶原酶混合消化法结合差速贴壁法制备而来
，细胞总量约为5×10⁵cells/瓶
。

质量检测

实验室分离的兔胚肺成纤维经Vimentin免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1
、HBV
、HCV、支原体

、细菌、酵母和真菌等。

培养信息
：

培养基：含FBS
、生长添加剂、Penicillin

、Streptomycin等

换液频率：每2-3天换液一次

生长特性：贴壁

细胞形态：成纤维细胞样

传代特性：可传5代左右；3代以内状态佳

消化液：0.25%

培养条件

：气相：空气，95%；CO2

，5%

兔胚肺成纤维体外培养周期有限
；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养

，以此保证该细胞的佳培养状态
。

注意事项：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和老哥俱乐部联系。

2. 仔细阅读细胞说明书
，了解细胞相关信息
，如细胞形态

、所用培养基
、血清比例、所需细胞因子等
，确保细胞培养条件一致，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担
。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态。因运输问题，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片，是正常现象。观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h。

4. 贴壁细胞可以消化
，悬浮细胞直接混匀收集细胞，900 rpm-1000 rpm离心3 min
，弃上清。加5 mL PBS重悬细胞

，再900 rpm-1000 rpm离心3 min
，

，用新鲜的*培养基重悬细胞，并接种到新的培养瓶或培养皿中
，置于培养箱中进行培养。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养
。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片
，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流。由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和老哥俱乐部联系，告知细胞的具体情况
，以便老哥俱乐部的技术人员跟踪回访直至问题解决。

7. 该细胞仅供科研使用。

8. 备注：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞。收到细胞后次传代建议1：2传代 。

9.注意： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿。不是1个T25瓶传2个10cm皿。

公司正在出售的产品：

大鼠T细胞活化核因子5(NFAT5)检测试剂盒 
，英文名： NFAT5 ELISA Kit

Mice of low density lipoprotein immune complexes (LDL-IC) ELISA Kit 小鼠低密度脂蛋白免疫复合物(LDL-IC)检测试剂盒

ELISA 小鼠性激素结合球蛋白(mouse SHBG)  进口分装

CLIAKitforIGFBP-1(MouseInsulin-likegrowthfactorbindingprotein1)ELISAKit小鼠胰岛素样生长因子结合蛋白1

通用型牛新孢子虫病(Neosporacaninum)试剂盒20次

ELISAKitCYP2E1大鼠细胞色素P4502E1

TNFSF10重组小鼠 TNFSF10 / TRAIL / APO-2L 蛋白 (aa 118-291, His 标签) Protein

叉头框蛋白O1(FOXO1)重组蛋白 Recombinant Forkhead Box Protein O1 (FOXO1)

SIGIRR重组人 SIGIRR / TIR8 蛋白 (Fc 标签) Protein

IL13 Protein Human 重组人 IL13 / ALRH 蛋白

IL8 Protein Cynomolgus 重组食蟹猴 IL-8 / CXCL8 蛋白

ADM (Adrenomedullin 0.1mgADM (Adrenomedullin)(22-52) 肾上腺髓质素(22-52)

IL13 Protein Human 重组人 IL13 / ALRH 蛋白

HSPD1重组小鼠 HSPD1 / HSP60 蛋白 Protein

IL13RA2 Protein Rat 重组大鼠 IL13RA2 / IL13R 蛋白

MET重组人 c-MET / HGFR 蛋白 (aa 956-1390, His & GST 标签) Protein

豚鼠嗜酸粒细胞趋化因子(ECF)检测试剂盒

，英文名： ECF ELISA Kit

Human blocking aibody (BA) ELISA Kit 人封闭抗体(BA)检测试剂盒

rabbitsolubleE-selectin,sE-selectinELISAKit 兔子可溶性E选择素(sE-selectin)检测试剂盒 96T/48T 进口分装

CLIAKitforBB-Ab(Humanai-Bburgdorleriaibody)ELISAKit人抗BB抗体

酰胺水解活力(AMINOLYTIC)检测试剂盒20次

RabbitCollagenaseIELISAKit兔子胶原酶I(CollagenaseI)检测试剂盒规格：96T/48T

兔胚肺成纤维细胞神经生长因子   英文名称

：    nerve growth factor    规格：      英文缩写
：   NGF

神经生长因子受体   英文名称
：    nerve growth factor  receptor   规格：      英文缩写

：   NGFR

中性粒细胞明胶酶相关性载脂蛋白   英文名称
：   Neuophil gelatinase-associated lipocalin   规格：      英文缩写：   NGAL

神经营养素3   英文名称：   Neuroophin-3   规格：      英文缩写：   -3