實驗報告 ：

一 、分離與培養 ：

1 、無菌條件下 ，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織 ，然後用PBS將此組織塊清洗2次 ，將組織剪成1mm3左右大小 ；

2 、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶） ，混懸10s ，置37℃條件下消化10min ，之後用滴管吹打製成單細胞懸液 ，自然沉澱並收集上清 ，用含10% FBS培養基終止消化後4℃放置 ；

3 、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液 ，混懸10s ，置37℃消化10 min後 ，按上述方法收集上清並終止消化後4℃放置 ，重複此步驟2-3次 ，直至組織被消化 ；

4 、用200目不鏽鋼篩網過濾細胞消化液 ，1200r/min 離心10min ，棄去上清 ，沉澱細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養基混懸 ，接種於25cm2培養瓶 ，放置於37℃ ，5％CO2 培養箱中培養 ；

5 、差速貼壁1h後 ，吸出培養基 ，按實驗需要接種於6孔板中繼續培養 ；二 、免疫熒光鑒定 ：

1 、待心房肌細胞生長至80%融合時 ，棄去培養基 ，用溫育的PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min ；

2 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在4℃條件下 ，用0.1％Triton X-100透膜15min ；

3 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在室溫條件下 ，用4% BSA封閉細胞30min ；

4 、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然後將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜 ；

5 、PBS衝洗細胞3次 ，每次10min ，按1 ：150的比例稀釋抗α-actin的二抗 ， 37℃條件下放置1h ；

6 、用PBS衝洗3次，每次10min ，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像並拍照 。

細胞簡介 ：

兔結腸平滑肌分離自結腸組織 ；結腸在右髂窩內續於盲腸 ，在第3骶椎平麵連接直腸 。結腸分升結腸 、橫結腸 、降結腸和乙狀結腸4部分 ，大部分固定於腹後壁 ，結腸的排列酷似英文字母“M" ，將小腸包圍在內 。結腸橫切麵由內到外依次為 ：黏膜（上皮層 、固有層 、黏膜肌層） ，黏膜下層（疏鬆結締組織） ，肌層（內環形 、外縱行兩層平滑肌），外膜（纖維膜或漿膜） 。結腸平滑肌細胞主要分布於黏膜肌層和肌層的內環形 、外縱行平滑肌 ；結腸運動少而緩慢 ，對刺激的反應也較遲緩 。結腸平滑肌在食物消化與吸收 、腸道運動和物質分泌 、誘發全身炎症反應以及細胞內信號轉導途徑等研究中起著重要的作用。結腸平滑肌細胞原代分離培養3天後 ，可見細胞貼壁伸展 ，細胞形態大小不一，呈梭形 、不規則形 、三角形或扇形 ，核卵圓形 、居中 ；2周後細胞匯合 ，多數細胞伸展呈長梭形 ，胞漿豐富 ，有分枝狀突起 ，細胞平行排列成單層或部分區域多層重疊生長 ，高低起伏 ；細胞密度低時 ，常交織成網狀 ；密度高時 ，則排列為旋渦狀或柵欄狀 。傳代後細胞生長較快 ，4-6天即可匯合 ，並保持上述形態學特征和生長特點 。結腸平滑肌運動活性受到神經遞質 、胃腸激素和藥物等因素的調節 。隨著現代胃腸動力學研究的進展 ，對胃腸運動的研究已從器官 、組織水平發展到細胞 、分子水平 ，要求在胃腸道單個平滑肌細胞標本上來完成各種電生理 、藥理和分子生物學等實驗 。體外培養細胞，由於影響因素單一 ，是研究細胞功能以及相應的細胞信號轉導機製的基礎。

方法簡介 ：

實驗室分離的兔結腸平滑肌采用-膠原酶聯合消化法結合差速貼壁法製備而來 ，細胞總量約為5×10⁵cells/瓶 。

質量檢測

實驗室分離的兔結腸平滑肌經α-SMA免疫熒光鑒定 ，純度可達90%以上 ，且不含有HIV-1 、HBV 、HCV 、支原體、細菌 、酵母和真菌等 。

培養信息 ：

培養基 ：含FBS 、生長添加劑 、Penicillin 、Streptomycin等

換液頻率 ：每2-3天換液一次

生長特性 ：貼壁

細胞形態 ：成纖維細胞樣

傳代特性 ：可傳5代左右 ；3代以內狀態佳

消化液 ：0.25%

培養條件 ：氣相 ：空氣 ，95% ；CO2 ，5%

兔結腸平滑肌體外培養周期有限 ；建議使用配套的專用生長培養基及正確的操作方法來培養 ，以此保證該細胞的佳培養狀態 。

注意事項 ：

1. 收到細胞後首先觀察細胞瓶是否完好 ，培養液是否有漏液 、渾濁等現象 ，若有上述現象發生請及時和老哥俱樂部聯係 。

2. 仔細閱讀細胞說明書 ，了解細胞相關信息 ，如細胞形態 、所用培養基 、血清比例 、所需細胞因子等 ，確保細胞培養條件一致 ，若由於培養條件不一致而導致細胞出現問題 ，責任由客戶自行承擔 。

3. 用75%酒精擦拭細胞瓶表麵 ，顯微鏡下觀察細胞狀態 。因運輸問題 ，部分細胞由於溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片 ，是正常現象 。觀察好細胞狀態後 ，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置於37℃培養箱放置4-6h 。

4. 貼壁細胞可以消化 ，懸浮細胞直接混勻收集細胞 ，900 rpm-1000 rpm離心3 min ，棄上清 。加5 mL PBS重懸細胞 ，再900 rpm-1000 rpm離心3 min ， ，用新鮮的*培養基重懸細胞 ，並接種到新的培養瓶或培養皿中 ，置於培養箱中進行培養 。

5. 請客戶用相同條件的培養基用於細胞培養 。

6. 建議客戶收到細胞後前3天各拍幾張細胞照片 ，記錄細胞狀態 ，便於和我司技術部溝通交流 。由於運輸的原因 ，個別敏感細胞會出現不穩定的情況 ，請及時和老哥俱樂部聯係 ，告知細胞的具體情況 ，以便老哥俱樂部的技術人員跟蹤回訪直至問題解決 。

7. 該細胞僅供科研使用 。

8. 備注 ：運輸用的培養基(灌液培養基)不能再用來培養細胞 ，請換用按照說明書細胞培養條件新配製的*培養基來培養細胞 。收到細胞後次傳代建議1 ：2傳代  。

9.注意 ： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿 。不是1個T25瓶傳2個10cm皿 。

公司正在出售的產品 ：

酰基轉移酶（AAT）試劑盒   可見分光光度法   50管/48樣

脫羧酶（PDC）試劑盒   紫外分光光度法    50管/48樣

脂蛋白酯酶（LPL）＆肝脂酶（HL）試劑盒   可見分光光度法    50管/24樣

甘油三酯（TG）含量測定試劑盒   可見分光光度法    50管/48樣

小鼠二酰基甘油(DAG/DG)試劑盒

Rat endothelial niic oxide syhase 3 (eNOS-3) ELISA Kit 大鼠內皮型合成酶3(eNOS-3)試劑盒

Humahrombihrombomodulincompound,T-TMELISAKit 人血栓調節蛋白複合物(T-TM)試劑盒 進口分裝

Humanapoptosisproteaseactivatingfactor-1,Apaf-1試劑盒人凋亡蛋白酶激活因子1(Apaf-1)試劑盒

植物葉片活性葉綠體分離試劑盒20次

Humaissueinhibitorsofmetalloproteinase4 ，TIMP-4ELISAKit人基質金屬蛋白酶抑製因子4(TIMP-4)試劑盒

CSNK2A1重組小鼠 CSNK2A1 / CK2A1 蛋白 (His & GST 標簽) Protein

促生長激素釋放激素(GHRH)重組蛋白 Recombinant Growth Hormone Releasing Hormone (GHRH)

LIF重組人 LIF 蛋白  Protein

FCGR3A Protein Human 重組人 CD16a / FCGR3A 蛋白 (176 Val, His & AVI 標簽)

TNFSF8 Protein Cynomolgus 重組食蟹猴 CD153 / CD30L / TNFSF8 蛋白 (His 標簽)

AD7C-NTP/NTP/AF peptide 神經絲蛋白蛋白多肽抗原(人 0.5mgAD7C-NTP/NTP/AF peptide 神經絲蛋白蛋白多肽抗原(人)

FCGR3A Protein Human 重組人 CD16a / FCGR3A 蛋白 (176 Val, His & AVI 標簽)

FCGR1重組小鼠 CD64 / FCGR1 蛋白 (His & AVI 標簽), Biotinylated Protein

REG4 Protein Rat 重組大鼠 REG4 蛋白 (His 標簽)

MSLN重組人 MSLN / Mesothelin 蛋白  Protein

兔結腸平滑肌細胞大鼠類(TPS)試劑盒  ，英文名： TPS ELISA Kit

Mouse free prostate specific aigen (fPSA) ELISA Kit 小鼠遊離前列腺特異性抗原(fPSA)試劑盒

Ratapelin12,AP12ELISAKit 大鼠apelin12(AP12)試劑盒 進口分裝

CLIAKitforGABA(HumanGamma-aminobyricacid)ELISAKit人γ氨基

細胞過氧化氫(HYDROGENPEROXIDE)活性熒光定量試劑盒20次

RatProgesterone,PROGELISAKit大鼠孕激素/孕同(PROG)試劑盒