實驗報告 ：

一 、分離與培養 ：

1 、無菌條件下 ，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織 ，然後用PBS將此組織塊清洗2次 ，將組織剪成1mm3左右大小 ；

2 、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶） ，混懸10s，置37℃條件下消化10min ，之後用滴管吹打製成單細胞懸液 ，自然沉澱並收集上清 ，用含10% FBS培養基終止消化後4℃放置 ；

3 、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液 ，混懸10s ，置37℃消化10 min後 ，按上述方法收集上清並終止消化後4℃放置 ，重複此步驟2-3次 ，直至組織被消化 ；

4 、用200目不鏽鋼篩網過濾細胞消化液 ，1200r/min 離心10min ，棄去上清 ，沉澱細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養基混懸 ，接種於25cm2培養瓶，放置於37℃  ，5％CO2 培養箱中培養 ；

5 、差速貼壁1h後 ，吸出培養基，按實驗需要接種於6孔板中繼續培養 ；二 、免疫熒光鑒定 ：

1 、待心房肌細胞生長至80%融合時 ，棄去培養基 ，用溫育的PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min ；

2、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在4℃條件下 ，用0.1％Triton X-100透膜15min ；

3 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在室溫條件下 ，用4% BSA封閉細胞30min ；

4 、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗 ，然後將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜 ；

5 、PBS衝洗細胞3次 ，每次10min ，按1 ：150的比例稀釋抗α-actin的二抗 ， 37℃條件下放置1h ；

6 、用PBS衝洗3次 ，每次10min ，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像並拍照 。

細胞簡介 ：

兔骨髓樹突狀分離自骨髓 ；骨髓是機體的造血組織 ，位於身體的許多骨骼內 。成年動物的骨髓分兩種 ：紅骨髓和黃骨髓 。紅骨髓能製造紅細胞 、血小板和各種白細胞 。血小板有止血作用 ，白細胞能殺滅與抑製各種病原體 ，包括細菌 、病毒等 ；某些淋巴細胞能製造抗體 。因此 ，骨髓不但是造血器官 ，它還是重要的免疫器官 。骨髓是存在於長骨（如肱骨 、股骨）的骨髓腔和扁平骨（如髂骨）的稀鬆骨質間的網眼中 ，是一種海綿狀的組織 ，能產生血細胞的骨髓略呈紅色 ，稱為紅骨髓 。出生時 ，紅骨髓充滿全身骨髓腔 ，隨著年齡增大 ，脂肪細胞增多 ，相當部分紅骨髓被黃骨髓取代 ，後幾乎隻有扁平骨骨髓腔中有紅骨髓 。骨髓DC細胞是由骨髓單核細胞誘導而成的 ；樹突狀細胞分為成熟樹突狀細胞和未成熟樹突狀細胞 ，典型的未成熟樹突狀細胞呈半貼壁生長 ，在GM-CSF 、IL4的作用下形成葡萄串樣集落 ，細胞大而形態不規則 ，表麵皺褶多 ，亦可見少量短刺狀突 ，胞內細胞器豐富並可見吞噬泡 ，具有較強的遷移能力 ，伴隨有部分未誘導成的單核細胞 ，貼壁形態多樣 。而成熟的樹突狀細胞由未成熟DC進一步經TNFα 、LPS等誘導而成 ，多數呈懸浮生長 ， 細胞呈圓形，細胞體積進一步增大 ，表麵大量粗細不等的樹枝樣突起（高倍鏡或者電鏡下可觀察到 ） ，伴隨少量貼壁未成熟細胞或者單核細胞 。未成熟DC細胞長時間培養也可能導致自發分化成熟 。DC細胞尚無特異性細胞表麵分子標誌 ，主要通過形態學 、組合性細胞表麵標誌 、在混合淋巴細胞反應中能激活初始T細胞等特征進行鑒定 。其中成熟樹突狀細胞表麵高表達主要組織相容性複合物（MHC）以及CD80 、CD86等共刺激分子 ，進而激活T淋巴細胞 ，誘導免疫應答 ，處於啟動 、調控 、並維持免疫應答的中心環節 ；未成熟樹突狀細胞具有很強的抗原攝取加工能力 ，但由於缺乏多種共刺激分子不能使初始T細胞活化 、增殖產生免疫應答 ，不能激活T細胞的信號 ，可導致T細胞無能 ，從而誘導免疫低反應或抗原免疫特異性耐受 。未成熟樹突狀細胞表麵CD80 、CD86 、MHC-Ⅱ類分子等共刺激分子表達較低 ，一般在30%以下 。

方法簡介：

實驗室分離的兔骨髓未成熟DC采用密度梯度離心法分離骨髓單個核細胞 、培養過程添加細胞因子誘導而來 ，細胞總量約為5×10⁵cells/瓶 。

質量檢測

實驗室分離的兔骨髓樹突狀(未成熟DC細胞)經CD86免疫熒光鑒定 、細胞形態等綜合鑒定 ，純度可達80%以上 ，且不含有HIV-1 、HBV 、HCV 、支原體 、細菌 、酵母和真菌等 。

培養信息 ：

培養基 ：含FBS 、生長添加劑 、Penicillin 、Streptomycin等

換液頻率 ：每2-3天換液一次

生長特性 ：半貼壁半懸浮

細胞形態 ：圓形 、梭形 、多角形，形態多樣

傳代特性 ：屬於高度分化細胞 ；屬於不增殖細胞群

消化液 ：0.25%

培養條件 ：氣相 ：空氣 ，95% ；CO2 ，5%

兔骨髓樹突狀(未成熟DC細胞)體外培養周期有限 ；建議使用配套的專用生長培養基及正確的操作方法來培養 ，以此保證該細胞的佳培養狀態 。

注意事項 ：

1. 收到細胞後首先觀察細胞瓶是否完好 ，培養液是否有漏液 、渾濁等現象 ，若有上述現象發生請及時和老哥俱樂部聯係 。

2. 仔細閱讀細胞說明書 ，了解細胞相關信息 ，如細胞形態 、所用培養基 、血清比例 、所需細胞因子等 ，確保細胞培養條件一致 ，若由於培養條件不一致而導致細胞出現問題 ，責任由客戶自行承擔 。

3. 用75%酒精擦拭細胞瓶表麵 ，顯微鏡下觀察細胞狀態 。因運輸問題 ，部分細胞由於溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片 ，是正常現象 。觀察好細胞狀態後 ，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置於37℃培養箱放置4-6h 。

4. 貼壁細胞可以消化 ，懸浮細胞直接混勻收集細胞 ，900 rpm-1000 rpm離心3 min ，棄上清 。加5 mL PBS重懸細胞 ，再900 rpm-1000 rpm離心3 min ， ，用新鮮的*培養基重懸細胞 ，並接種到新的培養瓶或培養皿中 ，置於培養箱中進行培養 。

5. 請客戶用相同條件的培養基用於細胞培養 。

6. 建議客戶收到細胞後前3天各拍幾張細胞照片 ，記錄細胞狀態 ，便於和我司技術部溝通交流 。由於運輸的原因 ，個別敏感細胞會出現不穩定的情況 ，請及時和老哥俱樂部聯係 ，告知細胞的具體情況 ，以便老哥俱樂部的技術人員跟蹤回訪直至問題解決 。

7. 該細胞僅供科研使用 。

8. 備注 ：運輸用的培養基(灌液培養基)不能再用來培養細胞 ，請換用按照說明書細胞培養條件新配製的*培養基來培養細胞 。收到細胞後次傳代建議1 ：2傳代  。

9.注意 ： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿 。不是1個T25瓶傳2個10cm皿 。

公司正在出售的產品 ：

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人主要組織相容性複合體Ⅰ類檢測試劑盒  人主要組織相容性複合體Ⅰ類試劑盒   規格型號 ：96T/48T   人主要組織相容性複合體Ⅰ類試劑盒 ，規格型號 ：96T/48T ，來源 ：檢測試劑盒（進口分裝） ，產品別名 ：人主要組織相容性複合體Ⅰ類試劑盒 、人主要組織相容性複合體Ⅰ類 檢測試劑盒   保存條件：2-8℃   保質期 ：6個月 。

人軸突生長誘向因子4檢測試劑盒   人軸突生長誘向因子4試劑盒   規格型號 ：96T/48T   人軸突生長誘向因子4試劑盒 ，規格型號 ：96T/48T ，來源 ：檢測試劑盒（進口分裝） ，產品別名：人軸突生長誘向因子4試劑盒 、人軸突生長誘向因子4 檢測試劑盒   保存條件 ：2-8℃   保質期 ：6個月 。

人軸突生長誘向因子1檢測試劑盒   人軸突生長誘向因子1試劑盒   規格型號 ：96T/48T   人軸突生長誘向因子1試劑盒 ，規格型號 ：96T/48T ，來源 ：檢測試劑盒（進口分裝） ，產品別名 ：人軸突生長誘向因子1試劑盒 、人軸突生長誘向因子1 檢測試劑盒   保存條件 ：2-8℃   保質期 ：6個月 。