實驗報告 ：

一 、分離與培養 ：

1、無菌條件下 ，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織 ，然後用PBS將此組織塊清洗2次 ，將組織剪成1mm3左右大小 ；

2 、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶） ，混懸10s ，置37℃條件下消化10min ，之後用滴管吹打製成單細胞懸液 ，自然沉澱並收集上清 ，用含10% FBS培養基終止消化後4℃放置 ；

3 、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液 ，混懸10s ，置37℃消化10 min後 ，按上述方法收集上清並終止消化後4℃放置 ，重複此步驟2-3次 ，直至組織被消化 ；

4 、用200目不鏽鋼篩網過濾細胞消化液 ，1200r/min 離心10min ，棄去上清 ，沉澱細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養基混懸 ，接種於25cm2培養瓶 ，放置於37℃  ，5％CO2 培養箱中培養 ；

5 、差速貼壁1h後 ，吸出培養基 ，按實驗需要接種於6孔板中繼續培養 ；二 、免疫熒光鑒定 ：

1 、待心房肌細胞生長至80%融合時 ，棄去培養基 ，用溫育的PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min ；

2 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在4℃條件下 ，用0.1％Triton X-100透膜15min ；

3 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在室溫條件下 ，用4% BSA封閉細胞30min ；

4 、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗 ，然後將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜 ；

5 、PBS衝洗細胞3次 ，每次10min ，按1 ：150的比例稀釋抗α-actin的二抗 ， 37℃條件下放置1h ；

6 、用PBS衝洗3次 ，每次10min ，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像並拍照 。

細胞簡介 ：

人食管癌成纖維分離自食管癌組織 ；食管癌是常見的消化道腫瘤 ，每年約有30萬人死於食管癌 。其發病率和死亡率各國差異很大 。我國是世界上食管癌高發地區之一 ，每年平均病死約15萬人 。男多於女，發病年齡多在40歲以上 。食管癌典型的症狀為進行性咽下困難，先是難咽幹的食物 ，繼而是半流質食物 ，後水和唾液也不能咽下 。成纖維細胞(Fibroblast)是疏鬆結締組織的主要細胞成分 ，由胚胎時期的間充質細胞分化而來 。成纖維細胞較大 ，輪廓清楚 ，多為突起的紡錘形或星形的扁平狀結構 ，其細胞核呈規則的卵圓形 ，核仁大而明顯 。成纖維細胞功能活動旺盛 ，細胞質嗜弱堿性 ，具明顯的蛋白質合成和分泌活動 ，在一定條件下 ，它可以實現跟纖維細胞的互相轉化 ；成纖維細胞對不同程度的細胞變性 、壞死和組織缺損的修複有著十分重要的作用 。剛分離的成纖維細胞呈圓形 、折光性良好 ，懸浮於培養基中 。30min細胞貼壁 ，其中部分開始伸出偽足 ，表現為小的突起 ；6h後細胞基本貼壁 ，伸展成梭形 ，胞核清晰 ，分布較均勻 ，散在生長 ，不聚集成團 ；細胞生長迅速 ，5-7天即呈融合狀態 ，細胞排列緊密，有的交叉重疊生長 ，平坦 、胞體較大 ，細胞質透明 ，細胞核較大 ，呈橢圓形 ，顏色淡 。細胞融合 ，並彼此連接成網狀 ；細胞呈突起的紡錘形或星形的扁平分布 。

方法簡介 ：

實驗室分離的人食管癌成纖維采用 - 膠原酶混合酶消化後差速貼壁製備而來 ，細胞總量約為5×10⁵cells/瓶 。

質量檢測

實驗室分離的人食管癌成纖維經Vimentin免疫熒光鑒定，純度可達90%以上 ，且不含有HIV-1 、HBV 、HCV 、支原體 、細菌 、酵母和真菌等 。

培養信息 ：

培養基 ：含FBS 、生長添加劑 、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率 ：每2-3天換液一次

生長特性 ：貼壁

細胞形態 ：成纖維細胞樣

傳代特性 ：可傳5代左右 ；3代以內狀態佳

消化液 ：0.25%

培養條件：氣相 ：空氣 ，95% ；CO2 ，5%

人食管癌成纖維體外培養周期有限 ；建議使用配套的專用生長培養基及正確的操作方法來培養 ，以此保證該細胞的佳培養狀態 。

注意事項 ：

1. 收到細胞後首先觀察細胞瓶是否完好 ，培養液是否有漏液 、渾濁等現象 ，若有上述現象發生請及時和老哥俱樂部聯係 。

2. 仔細閱讀細胞說明書 ，了解細胞相關信息 ，如細胞形態 、所用培養基 、血清比例 、所需細胞因子等 ，確保細胞培養條件一致 ，若由於培養條件不一致而導致細胞出現問題 ，責任由客戶自行承擔 。

3. 用75%酒精擦拭細胞瓶表麵，顯微鏡下觀察細胞狀態 。因運輸問題 ，部分細胞由於溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片 ，是正常現象 。觀察好細胞狀態後 ，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置於37℃培養箱放置4-6h 。

4. 貼壁細胞可以消化 ，懸浮細胞直接混勻收集細胞 ，900 rpm-1000 rpm離心3 min ，棄上清 。加5 mL PBS重懸細胞 ，再900 rpm-1000 rpm離心3 min ， ，用新鮮的*培養基重懸細胞 ，並接種到新的培養瓶或培養皿中 ，置於培養箱中進行培養 。

5. 請客戶用相同條件的培養基用於細胞培養 。

6. 建議客戶收到細胞後前3天各拍幾張細胞照片 ，記錄細胞狀態 ，便於和我司技術部溝通交流 。由於運輸的原因 ，個別敏感細胞會出現不穩定的情況 ，請及時和老哥俱樂部聯係 ，告知細胞的具體情況 ，以便老哥俱樂部的技術人員跟蹤回訪直至問題解決 。

7. 該細胞僅供科研使用 。

8. 備注 ：運輸用的培養基(灌液培養基)不能再用來培養細胞 ，請換用按照說明書細胞培養條件新配製的*培養基來培養細胞 。收到細胞後次傳代建議1 ：2傳代  。

9.注意 ： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿 。不是1個T25瓶傳2個10cm皿 。

公司正在出售的產品 ：

大鼠蛋白激酶抑製因子γ(PKIγ)檢測試劑盒  ，英文名 ： PKIγ ELISA Kit

L phenylalanine ammonia lyase (PAL) ELISA Kit 人L苯解氨酶(PAL)檢測試劑盒

RatIerleukin5,IL-5ELISAKIT 大鼠白介素5(IL-5)檢測試劑盒 96T/48T 進口分裝

CLIAKitforCyclin-D3ELISAKit大鼠細胞周期素D3

細胞色素P450亞酶CYP2C19(CEC)活性熒光定量檢測試劑盒20次

RatFibronectin,FNELISAKit大鼠纖連蛋白(FN)檢測試劑盒規格 ：96T/48T

DLL1重組大鼠 DLL1 / Delta-like Protein 1 蛋白 (Fc 標簽) Protein

CRF (Corticotropin-Releasing Factor 0.5mgCRF (Corticotropin-Releasing Factor) 促腎上腺皮質激素釋放因子

AGO3重組人 AGO3 / Argonaute 3 / EIF2C3 蛋白 Protein

IL17RC Protein Human 重組人 IL17RC 蛋白 (aa 1-454, His 標簽)

EPOR Protein Mouse 重組小鼠 EPOR 蛋白

CRF (Corticotropin-Releasing Factor 0.5mgCRF (Corticotropin-Releasing Factor) 促腎上腺皮質激素釋放因子

IL17RC Protein Human 重組人 IL17RC 蛋白 (aa 1-454, His 標簽)

DLL1重組大鼠 DLL1 / Delta-like Protein 1 蛋白 (Fc 標簽) Protein

EPOR Protein Mouse 重組小鼠 EPOR 蛋白

AGO3重組人 AGO3 / Argonaute 3 / EIF2C3 蛋白 Protein

豚鼠免疫球蛋白E(IgE)ELISA 試劑盒 96T/48T

Human cytotoxin associated protein A (CagA) ELISA Kit 人細胞毒素相關蛋白A(CagA)檢測試劑盒

Humanai-cardiolipinaibodyIgM,ACA-IgMELISAKit 人抗心0脂抗體IgM(ACA-IgM)檢測試劑盒 96T/48T 進口分裝

Humancaneouslymphocyte-associatedaigen,CLA檢測試劑盒人皮膚淋巴細胞相關抗原(CLA)檢測試劑盒規格 ：96T/48T

組織EPHB3激酶活性定量檢測試劑盒(A/B/C)20次

humanprogestinandadipoQreceptorfamilymemberⅦ,PAQR7ELISAKit人孕同和adipoQ受體家族成員Ⅶ(PAQR7)檢測試劑盒規格 ：96T/48T

人食管癌成纖維細胞三(羥甲基)基鹽酸鹽   100g

is,Hydrochloride   500g

曲拉通X-100   100ml

itonX-100   250ml