實驗報告 ：

一 、分離與培養 ：

1 、無菌條件下 ，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織 ，然後用PBS將此組織塊清洗2次 ，將組織剪成1mm3左右大小 ；

2 、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶） ，混懸10s ，置37℃條件下消化10min ，之後用滴管吹打製成單細胞懸液 ，自然沉澱並收集上清 ，用含10% FBS培養基終止消化後4℃放置 ；

3 、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液 ，混懸10s ，置37℃消化10 min後 ，按上述方法收集上清並終止消化後4℃放置 ，重複此步驟2-3次 ，直至組織被消化 ；

4 、用200目不鏽鋼篩網過濾細胞消化液 ，1200r/min 離心10min ，棄去上清 ，沉澱細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養基混懸 ，接種於25cm2培養瓶 ，放置於37℃  ，5％CO2 培養箱中培養 ；

5 、差速貼壁1h後 ，吸出培養基 ，按實驗需要接種於6孔板中繼續培養 ；二 、免疫熒光鑒定 ：

1 、待心房肌細胞生長至80%融合時 ，棄去培養基 ，用溫育的PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min ；

2 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在4℃條件下 ，用0.1％Triton X-100透膜15min ；

3 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min，然後在室溫條件下 ，用4% BSA封閉細胞30min ；

4 、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗 ，然後將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜 ；

5 、PBS衝洗細胞3次 ，每次10min ，按1 ：150的比例稀釋抗α-actin的二抗 ， 37℃條件下放置1h ；

6 、用PBS衝洗3次 ，每次10min ，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像並拍照 。

細胞簡介 ：

人乳腺癌血管內皮分離自患有乳腺癌的女性乳腺組織 ；女性乳腺是由皮膚 、纖維組織 、乳腺腺體和脂肪組成的 ，乳腺癌是發生在乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤 。乳腺癌中99%發生在女性 ，男性僅占1% 。乳腺並不是維持機體生命活動的重要器官 ，原位乳腺癌並不致命 ；但由於乳腺癌細胞喪失了正常細胞的特性 ，細胞之間連接鬆散 ，容易脫落 。癌細胞一旦脫落 ，遊離的癌細胞可以隨血液或淋巴液播散全身，形成轉移 ，危及生命 。目前 ，乳腺癌已成為威脅女性身心健康的常見腫瘤 。

方法簡介 ：

公司實驗室分離的人乳腺癌血管內皮采用-膠原酶混合消化法結合差速貼壁法 ，並通過內皮細胞專用培養基培養篩選製備而來 ，細胞總量約為5×10?cells/瓶 。

質量檢測

公司實驗室分離的人乳腺癌血管內皮經CD31免疫熒光鑒定 ，純度可達90%以上 ，且不含有HIV-1 、HBV 、HCV 、支原體 、細菌 、酵母和真菌等 。

培養信息 ：

包被條件 PLL（0.1mg/ml） ，明膠（0.1%）

培養基 含FBS 、生長添加劑 、Penicillin 、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細胞形態 內皮細胞樣

傳代特性 可傳2-3代

消化液 0.25%

培養條件 氣相 ：空氣 ，95% ；CO2 ，5%

注意事項 ：

1. 收到細胞後首先觀察細胞瓶是否完好 ，培養液是否有漏液 、渾濁等現象 ，若有上述現象發生請及時和老哥俱樂部聯係 。

2. 仔細閱讀細胞說明書 ，了解細胞相關信息 ，如細胞形態 、所用培養基 、血清比例 、所需細胞因子等 ，確保細胞培養條件一致 ，若由於培養條件不一致而導致細胞出現問題 ，責任由客戶自行承擔 。

3. 用75%酒精擦拭細胞瓶表麵 ，顯微鏡下觀察細胞狀態 。因運輸問題 ，部分細胞由於溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片 ，是正常現象 。觀察好細胞狀態後 ，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置於37℃培養箱放置4-6h 。

4. 貼壁細胞可以消化 ，懸浮細胞直接混勻收集細胞 ，900 rpm-1000 rpm離心3 min ，棄上清 。加5 mL PBS重懸細胞 ，再900 rpm-1000 rpm離心3 min ， ，用新鮮的*培養基重懸細胞 ，並接種到新的培養瓶或培養皿中 ，置於培養箱中進行培養 。

5. 請客戶用相同條件的培養基用於細胞培養 。

6. 建議客戶收到細胞後前3天各拍幾張細胞照片 ，記錄細胞狀態 ，便於和我司技術部溝通交流 。由於運輸的原因 ，個別敏感細胞會出現不穩定的情況 ，請及時和老哥俱樂部聯係 ，告知細胞的具體情況 ，以便老哥俱樂部的技術人員跟蹤回訪直至問題解決 。

7. 該細胞僅供科研使用 。

8. 備注 ：運輸用的培養基(灌液培養基)不能再用來培養細胞 ，請換用按照說明書細胞培養條件新配製的*培養基來培養細胞 。收到細胞後次傳代建議1 ：2傳代  。

9.注意： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿 。不是1個T25瓶傳2個10cm皿 。

公司正在出售的產品 ：

大鼠生長調節致癌基因γ(GROγ)檢測試劑盒  ，英文名 ： GROγ ELISA Kit

Mouse vitamin E (VE) ELISA Kit 小鼠(VE)檢測試劑盒

RatHistamine,HISELISAKit 大鼠組胺(HIS)檢測試劑盒 96T/48T 進口分裝

CLIAKitforHDELISAKit大鼠組織蛋白去乙酰化酶

細胞VEGFR1(FLT-1)激酶活性定量檢測試劑盒(A/B/C)20次

ELISAKitα-BGTα-銀環蛇毒素

EPHA3重組小鼠 EphA3 蛋白 Protein

降鈣素(CT)重組蛋白 Recombinant Calcitonin (CT)

CKM重組人 CKM / CK-MM 蛋白 Protein

CHST15 Protein Human 重組人 CHST15 / GALNAC4S-6ST / BRAG 蛋白

MET Protein Canine 重組狗 c-MET / HGFR 蛋白

降鈣素(CT)重組蛋白 Recombinant Calcitonin (CT)

CHST15 Protein Human 重組人 CHST15 / GALNAC4S-6ST / BRAG 蛋白

EPHA3重組小鼠 EphA3 蛋白 Protein

MET Protein Canine 重組狗 c-MET / HGFR 蛋白

CKM重組人 CKM / CK-MM 蛋白 Protein

小鼠胎盤生長因子(PLGF)ELISA 試劑盒 96T/48T

Rat activin A (Activin-A) ELISA Kit 大鼠活化素A(Activin-A)檢測試劑盒

Humangeneralanscriptioncomplex,GTCELISAKit 人通用轉錄複合體(GTC)檢測試劑盒 96T/48T 進口分裝

Deererythrocytemembraneprotein,EMP檢測試劑盒紅細胞膜蛋白(EMP)檢測試劑盒規格 ：96T/48T

載玻片細胞脘蛋白(PRION)蛋白表達熒光顯微鏡檢測試劑盒10/20次

MouseEndothelialniicoxidesyhase,eNOSELISAKit小鼠內皮型合成酶(eNOS)檢測試劑盒規格 ：96T/48T

人乳腺癌血管內皮細胞小鼠酸性成纖維生長因子(mouse a-FGF)   作用 ：   ELISA   規格 ：      進口分裝

小鼠堿性成纖維生長因子(mouse b-FGF/FGF-2)   作用 ：   ELISA   規格：      進口分裝

小鼠Fibronectin（mouse Fibronectin）   作用 ：   ELISA   規格 ：      進口分裝

小鼠Flt3(mouse Flt3)   作用 ：   ELISA   規格 ：      進口分裝