實驗報告 ：

一 、分離與培養 ：

1 、無菌條件下 ，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織 ，然後用PBS將此組織塊清洗2次 ，將組織剪成1mm3左右大小 ；

2 、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶） ，混懸10s ，置37℃條件下消化10min ，之後用滴管吹打製成單細胞懸液 ，自然沉澱並收集上清 ，用含10% FBS培養基終止消化後4℃放置 ；

3 、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液 ，混懸10s ，置37℃消化10 min後 ，按上述方法收集上清並終止消化後4℃放置 ，重複此步驟2-3次 ，直至組織被消化 ；

4 、用200目不鏽鋼篩網過濾細胞消化液 ，1200r/min 離心10min ，棄去上清 ，沉澱細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養基混懸 ，接種於25cm2培養瓶 ，放置於37℃  ，5％CO2 培養箱中培養 ；

5 、差速貼壁1h後 ，吸出培養基 ，按實驗需要接種於6孔板中繼續培養 ；二 、免疫熒光鑒定 ：

1 、待心房肌細胞生長至80%融合時 ，棄去培養基 ，用溫育的PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min ；

2 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在4℃條件下 ，用0.1％Triton X-100透膜15min ；

3 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在室溫條件下 ，用4% BSA封閉細胞30min ；

4 、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗 ，然後將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜 ；

5、PBS衝洗細胞3次 ，每次10min ，按1 ：150的比例稀釋抗α-actin的二抗 ， 37℃條件下放置1h ；

6 、用PBS衝洗3次 ，每次10min ，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像並拍照 。

細胞簡介 ：

人關節軟骨分離自關節軟骨組織 ；關節軟骨屬於透明軟骨 ，表麵光滑 、呈淡藍色 、有光澤 ，它是由一種特殊的叫做致密結締組織的膠原纖維構成的基本框架 ，這種框架呈半環形 ，類似拱形球門 ，其底端緊緊附著在下麵的骨質上 ，上端朝向關節麵 ，這種結構使關節軟骨緊緊與骨結合起來而不會掉下來 ，同時當受到壓力時候 ，還可以有少許的變形 ，起到緩衝壓力的作用 。在這些纖維之間 ，散在分布著軟骨細胞 ，軟骨細胞由淺層向深層逐漸由扁平樣至橢圓或圓形的細胞組成 ，這些軟骨細胞維持關節軟骨的正常代謝 。關節軟骨沒有神經支配 ，也沒有血管 ，其營養成分必須從關節液中取得 ，而其代謝廢物也必須排至關節液中 ，關節軟骨的這種營養代謝必須通過關節運動 ，使關節軟骨不斷的受到壓力刺激才行 ，所以關節運動對於維持關節軟骨的正常結構起重要的作用 。關節軟骨細胞位於關節軟骨陷窩內 。幼稚的關節軟骨細胞位於關節軟骨組織的表層 ，單個分布 、體積較小 、呈橢圓形 ，長軸與關節軟骨表麵平行 ，越向深層的關節軟骨細胞體積之間增大呈圓形 ，細胞核圓形或卵圓形 、染色淺 ，細胞質弱嗜堿性 ，常見數量不一的脂滴 。成熟的關節軟骨細胞多2-8個成群分布於關節軟骨陷窩內 ，這些關節軟骨細胞由同一個母細胞分裂增殖而成 ，稱為同源細胞群 。電鏡下 ，關節軟骨細胞有突起和皺褶 ，細胞質內有大量的粗麵內質網和發達的高爾基複合體及少量的線粒體 。在組織切片中 ，關節軟骨細胞收縮為不規則形 ，在軟骨囊和細胞之間出現較大的腔隙 。體外培養的關節軟骨細胞對於研究其生理功能 、藥物作用以及各種致病因素作用下的病理生理改變具重要意義 。

方法簡介 ：

公司實驗室分離的人關節軟骨采用膠原酶聯合消化製備而來 ，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

質量檢測

公司實驗室分離的人關節軟骨經Ⅱ型膠原蛋白免疫熒光鑒定 ，純度可達90%以上 ，且不含有HIV-1 、HBV 、HCV 、支原體 、細菌 、酵母和真菌等 。

培養信息 ：

培養基 含FBS 、生長添加劑 、Penicillin 、Streptomycin等

換液頻率 每3-4天換液一次

生長特性 貼壁

細胞形態 梭形 、多角形

傳代特性 可傳5代左右 ；3代以內狀態佳

消化液 0.25%

培養條件 氣相 ：空氣 ，95% ；CO2 ，5%

注意事項 ：

1. 收到細胞後首先觀察細胞瓶是否完好，培養液是否有漏液 、渾濁等現象 ，若有上述現象發生請及時和老哥俱樂部聯係 。

2. 仔細閱讀細胞說明書 ，了解細胞相關信息 ，如細胞形態 、所用培養基 、血清比例 、所需細胞因子等 ，確保細胞培養條件一致，若由於培養條件不一致而導致細胞出現問題 ，責任由客戶自行承擔 。

3. 用75%酒精擦拭細胞瓶表麵 ，顯微鏡下觀察細胞狀態 。因運輸問題 ，部分細胞由於溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片 ，是正常現象 。觀察好細胞狀態後 ，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置於37℃培養箱放置4-6h 。

4. 貼壁細胞可以消化 ，懸浮細胞直接混勻收集細胞 ，900 rpm-1000 rpm離心3 min ，棄上清 。加5 mL PBS重懸細胞 ，再900 rpm-1000 rpm離心3 min， ，用新鮮的*培養基重懸細胞 ，並接種到新的培養瓶或培養皿中 ，置於培養箱中進行培養 。

5. 請客戶用相同條件的培養基用於細胞培養 。

6. 建議客戶收到細胞後前3天各拍幾張細胞照片 ，記錄細胞狀態 ，便於和我司技術部溝通交流 。由於運輸的原因 ，個別敏感細胞會出現不穩定的情況 ，請及時和老哥俱樂部聯係 ，告知細胞的具體情況 ，以便老哥俱樂部的技術人員跟蹤回訪直至問題解決 。

7. 該細胞僅供科研使用 。

8. 備注 ：運輸用的培養基(灌液培養基)不能再用來培養細胞 ，請換用按照說明書細胞培養條件新配製的*培養基來培養細胞 。收到細胞後次傳代建議1 ：2傳代  。

9.注意 ： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿 。不是1個T25瓶傳2個10cm皿 。

公司正在出售的產品 ：

大鼠組蛋白乙酰基轉移酶1(HAT1)檢測試劑盒  ，英文名 ： HAT1 ELISA Kit

Nude mouse protein phosphatase (PP) ELISA Kit 裸鼠蛋酸酶(PP)檢測試劑盒

MouseIerleukin-7,IL-7ELISAkit 小鼠白介素7(IL-7)檢測試劑盒 96T/48T 進口分裝

CLIAKitforHumanmajorhistocompatibilitycomplexI,MHCI/HLAIELISAKit人主要組織相容性複合體Ⅰ類

土壤α活性DNS比色法定量檢測試劑盒20次

ELISAKitACA-IgM大鼠抗心0脂抗體IgM

EPHB4重組人 EphB4 / HTK 蛋白 Protein

熱休克蛋白47(HSP47)重組蛋白 Recombinant Heat Shock Protein 47 (HSP47)

FAM20B重組人 FAM20B / Gxk1 蛋白 (Fc 標簽) Protein

CFH Protein Human 重組人 Complement Factor H / CFH 蛋白

NA Protein H3N2 重組甲型流感 H3N2 神經酸酶 (Neuraminidase / NA) (R292K mutation) (高活性)

熱休克蛋白47(HSP47)重組蛋白 Recombinant Heat Shock Protein 47 (HSP47)

CFH Protein Human 重組人 Complement Factor H / CFH 蛋白

EPHB4重組人 EphB4 / HTK 蛋白 Protein

NA Protein H3N2 重組甲型流感 H3N2 神經酸酶 (Neuraminidase / NA) (R292K mutation) (高活性)

FAM20B重組人 FAM20B / Gxk1 蛋白 (Fc 標簽) Protein

小鼠透明質酸結合蛋白(HABP)ELISA 試劑盒 96T/48T

Rat receptor activator of nuclear factor kappa B ligand (RANKL) ELISA Kit 大鼠核因子κB受體活化因子配基(RANKL)檢測試劑盒

HumanICEprotease-activatingfactor,IRAPELISAKit 人ICE蛋白酶激活因子(IRAP)檢測試劑盒 96T/48T 進口分裝

ChickensolubleendothelialproteinCreceptor,sEPCR檢測試劑盒雞可溶性血管內皮細胞蛋白C受體(sEPCR)檢測試劑盒規格 ：96T/48T

載玻片細胞PDGF-A蛋白表達熒光顯微鏡檢測試劑盒10/20次

MouseFibrinogen,FbgELISAKit小鼠血纖蛋白原(Fbg)檢測試劑盒規格 ：96T/48T

人關節軟骨細胞小鼠褪黑素(MT)ELISAKit   ELISA.   96T/48T

小鼠載脂蛋白H(Apo-H)ELISAKit   ELISA.   96T/48T

小鼠熱休克因子1(HSF1)ELISAKit   ELISA.   96T/48T

小鼠血小板因子3(PF-3)ELISAKit   ELISA.   96T/48T