老哥俱乐部

实验报告
：

一、分离与培养：

1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织
，然后用PBS将此组织块清洗2次，将组织剪成1mm3左右大小；

2
、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶）
，混悬10s
，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液
，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

3
、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后
，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置
，重复此步骤2-3次
，直至组织被消化；

4
、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；

5、差速贴壁1h后
，吸出培养基
，按实验需要接种于6孔板中继续培养
；二、免疫荧光鉴定：

1
、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基
，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min
，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

2、PBS冲洗细胞2次，每次10min
，然后在4℃条件下
，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS冲洗细胞2次，每次10min
，然后在室温条件下
，用4% BSA封闭细胞30min；

4
、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜
；

5

、PBS冲洗细胞3次，每次10min

，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；

6、用PBS冲洗3次，每次10min，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

细胞简介：

人Ⅱ型肺泡上皮分离自肺组织；肺泡由单层上皮细胞构成的半球状囊泡。肺中的支气管经多次反复分枝成无数细支气管，它们的末端膨大成囊，囊的四周有很多突出的小囊泡
，即为肺泡。小肺泡细胞，又称I型肺泡细胞
，厚约0.1微米
，基底部是基底膜，无增殖能力

。大肺泡细胞
，又称Ⅱ型肺泡细胞
，分泌表面活性物质（二棕榈酰），以降低肺泡表面张力
。Ⅱ型肺泡细胞位于Ⅰ型肺泡细胞之间，数量较Ⅰ型肺泡细胞多
，但覆盖面积比Ⅰ型肺泡细胞小。细胞立方形或圆形,顶端突入肺泡腔
。细胞核圆形
，胞质着色浅、呈泡沫状。电镜下
，细胞游离而有少量微绒毛，胞质内富含线粒体和溶酶体，有较发达的粗面内质网和高尔基复合体。核上方有较多的分泌颗粒
，电子密度高、大小不等，直径约0.1-1.0μm颗粒内含有平行排列的板层状结构
，称为嗜饿性板层小体。小体内的主要成分为磷脂，以二棕榈酰为主
，此外还有糖胺多糖及蛋白质等。颗粒内物质释放出来后，在肺泡表面形成一层粘液层，称为表面活性物质（surfactant）
。表面活性物质有降低肺泡表面张力、稳定肺泡大小的作用
。呼气时肺泡缩小
，表面活性物质密度增加，表面张力降低，防止肺泡过度塌陷；吸气时肺泡扩张
，表面活性物质密度减小，肺泡回缩力加大，可防止肺泡过度膨胀
。表面活性物质的缺乏或变性均可引起肺不张，过度通气可造成表面活性物质缺乏；吸入毒气可直接破坏表面活性物质。Ⅱ型肺泡细胞有分裂

、增殖并分化为Ⅰ型肺泡细胞的潜能，故具有修复受损伤上皮的作用。

方法简介：

公司实验室分离的人Ⅱ型肺泡上皮采用弹性蛋白酶消化法制备而来制备而来

，细胞总量约为5×10?cells/瓶。

质量检测

公司实验室分离的人Ⅱ型肺泡上皮经SP-C免疫荧光鉴定
，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV
、HCV、支原体
、细菌、酵母和真菌等
。

培养信息：

包被条件 鼠尾胶原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培养基 含FBS、生长添加剂
、Penicillin
、Streptomycin等

换液频率 每2-3天换液一次

生长特性 贴壁

细胞形态 上皮细胞样

传代特性 可传1-2代左右

消化液 0.25%

培养条件 气相：空气，95%；CO2，5%

注意事项
：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和老哥俱乐部联系。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态
、所用培养基
、血清比例
、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态
。因运输问题
，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片，是正常现象。观察好细胞状态后

，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h
。

4. 贴壁细胞可以消化，悬浮细胞直接混匀收集细胞，900 rpm-1000 rpm离心3 min

，弃上清。加5 mL PBS重悬细胞，再900 rpm-1000 rpm离心3 min，，用新鲜的*培养基重悬细胞
，并接种到新的培养瓶或培养皿中
，置于培养箱中进行培养
。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养
。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流。由于运输的原因

，个别敏感细胞会出现不稳定的情况
，请及时和老哥俱乐部联系，告知细胞的具体情况，以便老哥俱乐部的技术人员跟踪回访直至问题解决。

7. 该细胞仅供科研使用
。

8. 备注：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞
，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞。收到细胞后次传代建议1

：2传代
。

9.注意： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿。不是1个T25瓶传2个10cm皿。

公司正在出售的产品：

(Fibrinogen)   作用
：   ELISA   规格
：      进口分装

人 Foxp3(Foxp3)   作用：   ELISA   规格：      进口分装

半乳糖凝集素 7 （ Galectin-7 ）   作用
：   ELISA   规格
：      进口分装

胃泌素 (Gasin)   作用
：   ELISA   规格：      进口分装

小鼠二0酸腺苷(ADP)ELISA 试剂盒

Rat endostatin (ES) ELISA Kit 大鼠内皮抑素(ES)试剂盒

HumanactivatedcoagulationfactorⅫ,FⅫaELISAKit 人活化Ⅻ(FⅫa)试剂盒 进口分装

Humanapoptosissignalregulatingkinase1,ASK-1试剂盒人凋亡信号调节激酶I(ASK-1)试剂盒

植物乙醇酸氧化酶(glycolateoxidase)活性比色法定量试剂盒20次

Humaissueinhibitorsofmetalloproteinase2，TIMP-2ELISAKit人基质金属蛋白酶抑制因子2(TIMP-2)试剂盒

FCGR4重组小鼠 CD16-2 / FCGR4 蛋白 (His & AVI 标签) Protein

Adenylate Kinase 1 (AK-1 0.5mgAdenylate Kinase 1 (AK-1) 腺苷酸激酶-1

FAM19A2重组人 FAM19A2 蛋白  Protein

FCGR3A Protein Human 重组人 CD16a / FCGR3A 蛋白 (176 Val, His & AVI 标签), Biotinylated

CLEC1A Protein Rat 重组大鼠 CLEC1A / CLEC-1 蛋白

Adenylate Kinase 1 (AK-1 0.5mgAdenylate Kinase 1 (AK-1) 腺苷酸激酶-1

FCGR3A Protein Human 重组人 CD16a / FCGR3A 蛋白 (176 Val, His & AVI 标签), Biotinylated

FCGR4重组小鼠 CD16-2 / FCGR4 蛋白 (His & AVI 标签) Protein

CLEC1A Protein Rat 重组大鼠 CLEC1A / CLEC-1 蛋白

FAM19A2重组人 FAM19A2 蛋白  Protein

人Ⅱ型肺泡上皮细胞大鼠诱导型合酶(NOS2)试剂盒
，英文名： NOS2 ELISA Kit

Mouse follistatin (FS) ELISA Kit 小鼠卵泡抑素(FS)试剂盒

Mousemaixmetalloproteinase3,MMP-3ELISAkit 小鼠基质金属蛋白酶3(MMP-3)试剂盒 进口分装

CLIAKitforHumanEamoebahistolyticaAigenELISAKit人痢疾内阿米巴抗原

细胞3-0酸甘油脱氢酶(GAPDH)活性酶动力比色法定量试剂盒20次

ELISAKitACV-RAb大鼠活化素A受体抗体