老哥俱乐部

实验报告：

一、分离与培养：

1、无菌条件下
，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织
，然后用PBS将此组织块清洗2次，将组织剪成1mm3左右大小
；

2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶）
，混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s
，置37℃消化10 min后
，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织被消化
；

4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min
，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬
，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；

5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养
；二、免疫荧光鉴定：

1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基


，用温育的PBS冲洗细胞2次
，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min
；

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗


，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；

5、PBS冲洗细胞3次，每次10min
，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h

；

6、用PBS冲洗3次，每次10min
，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

细胞简介：

大鼠骨髓树突状分离自骨髓
；骨髓是机体的造血组织，位于身体的许多骨骼内。成年动物的骨髓分两种
：红骨髓和黄骨髓。红骨髓能制造红细胞、血小板和各种白细胞。血小板有止血作用
，白细胞能杀灭与抑制各种病原体，包括细菌、病毒等
；某些淋巴细胞能制造抗体。因此，骨髓不但是造血器官，它还是重要的免疫器官。骨髓是存在于长骨(如肱骨、股骨)的骨髓腔和扁平骨(如髂骨)的稀松骨质间的网眼中，是一种海绵状的组织，能产生血细胞的骨髓略呈红色

，称为红骨髓。出生时，红骨髓充满全身骨髓腔，随着年龄增大，脂肪细胞增多，相当部分红骨髓被黄骨髓取代
，最后几乎只有扁平骨骨髓腔中有红骨髓

。骨髓DC细胞是由骨髓单核细胞诱导而成的；树突状细胞分为成熟树突状细胞和未成熟树突状细胞
，典型的未成熟树突状细胞呈半贴壁生长
，在GM-CSF
、IL4的作用下形成葡萄串样集落，细胞大而形态不规则，表面皱褶多，亦可见少量短刺状突
，胞内细胞器丰富并可见吞噬泡
，具有较强的迁移能力
，伴随有部分未诱导成的单核细胞，贴壁形态多样。而成熟的树突状细胞由未成熟DC进一步经TNFα、LPS等诱导而成，多数呈悬浮生长

， 细胞呈圆形，细胞体积进一步增大
，表面大量粗细不等的树枝样突起(高倍镜或者电镜下可观察到 )，伴随少量贴壁未成熟细胞或者单核细胞。未成熟DC细胞长时间培养也可能导致自发分化成熟。DC细胞尚无特异性细胞表面分子标志

，主要通过形态学、组合性细胞表面标志

、在混合淋巴细胞反应中能激活初始T细胞等特征进行鉴定。其中成熟树突状细胞表面高表达主要组织相容性复合物(MHC)以及CD80、CD86等共刺激分子

，进而激活T淋巴细胞，诱导免疫应答，处于启动
、调控、并维持免疫应答的中心环节；未成熟树突状细胞具有很强的抗原摄取加工能力，但由于缺乏多种共刺激分子不能使初始T细胞活化、增殖产生免疫应答，不能激活T细胞的信号，可导致T细胞无能，从而诱导免疫低反应或抗原免疫特异性耐受。未成熟树突状细胞表面CD80、CD86、MHC-Ⅱ类分子等共刺激分子表达较低，一般在30%以下。

方法简介
：

实验室分离的大鼠骨髓未成熟DC采用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞、培养过程添加细胞因子诱导而来，细胞总量约为5×10⁵cells/瓶

。

质量检测

实验室分离的大鼠骨髓树突状(未成熟DC细胞)经CD86免疫荧光鉴定、细胞形态等综合鉴定，纯度可达80%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等
。

培养信息：

培养基：含FBS
、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等

换液频率：每2-3天换液一次

生长特性

：半贴壁半悬浮

细胞形态：圆形、梭形
、多角形，形态多样

传代特性：属于高度分化细胞
；属于不增殖细胞群

消化液
：0.25%

培养条件：气相：空气，95%
；CO2，5%

大鼠骨髓树突状(未成熟DC细胞)体外培养周期有限
；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的培养状态。

注意事项：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和老哥俱乐部联系。

2. 仔细阅读细胞说明书
，了解细胞相关信息
，如细胞形态、所用培养基、血清比例
、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担
。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态


。因运输问题，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片，是正常现象。观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h
。

4. 贴壁细胞可以消化
，悬浮细胞直接混匀收集细胞，900 rpm-1000 rpm离心3 min，弃上清
。加5 mL PBS重悬细胞，再900 rpm-1000 rpm离心3 min，，用新鲜的*培养基重悬细胞，并接种到新的培养瓶或培养皿中，置于培养箱中进行培养。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养
。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片
，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流
。由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和老哥俱乐部联系
，告知细胞的具体情况，以便老哥俱乐部的技术人员跟踪回访直至问题解决。

7. 该细胞仅供科研使用。

8. 备注：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞
，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞。收到细胞后次传代建议1：2传代 
。

9.注意
： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿。不是1个T25瓶传2个10cm皿
。

公司正在出售的产品：

大鼠(AZT)检测试剂盒 ，英文名： AZT ELISA Kit

Porcine somatostatin (SS) ELISA Kit 猪(SS)检测试剂盒

木瓜特定基因序列(Papaya)核酸检测试剂盒 48T

CLIAKitforLTB4ELISAKit大鼠白三烯B4

体液组织蛋白酶L(CATHEPSINL)活性比色法定量检测试剂盒20次

ELISAKitHSP-40鸡热休克蛋白40

HA重组甲型流感 H5N2 (A/American green-winged teal/California/HKWF609/07) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 蛋白 Protein

rHBeAg(Hepatitis B Virus E Antigen protein 100ugrHBeAg(Hepatitis B Virus E Antigen protein) 重组乙肝病毒e抗原

VNN1重组人 VNN1 / Vanin-1 蛋白 Protein

CCL16 Protein Human 重组人 CCL16 / HCC-4 / NCC4 蛋白

GZMH Protein Human 重组人 Granzyme H 蛋白

rhBMP-2/BMP2 重组人骨形态发生蛋白-2 100ugrhBMP-2/BMP2 重组人骨形态发生蛋白-2

CCL16 Protein Human 重组人 CCL16 / HCC-4 / NCC4 蛋白

HA重组甲型流感 H6N1 (A/northern shoveler/California/HKWF115/2007) 血凝素HA1 (Hemagglutinin) 蛋白 Protein

HAPLN1 Protein Human 重组人 HAPLN1 蛋白

CCNA1重组人 CCNA1 / Cyclin-A1 蛋白 Protein

小鼠脂蛋白相关0脂酶A2(Lp-PL-A2)ELISA 试剂盒 96T/48T

Human anspoer associated with aigen processing (TAP) ELISA Kit 人抗原处理相关转运蛋白(TAP)检测试剂盒

Humahymusindependeaigen,TI-AgELISAKit 人非依赖性抗原(TI-Ag)检测试剂盒 96T/48T 进口分装

CLIAKitforAAA(Humanai-Actinaibody)ELISAKit人抗肌动蛋白抗体

胰腺脂酶活性比色法定量检测试剂盒20次

Mouseneurofilameprotein,NFELISAKit小鼠神经丝蛋白(NF)检测试剂盒规格：96T/48T

大鼠骨髓树突状细胞(未成熟DC细胞)血清铁   英文名称：   Human serum Lron   规格：      英文缩写：   Lron

可溶性ENG/sCD105   英文名称：   Human soluble Endoglin   规格
：      英文缩写：   ENG/sCD105

可溶性血管内皮生长因子受体1   英文名称：   Human soluble Fms.liketyrosinekinase Receptor 1   规格
：      英文缩写
：   sFLt-1

可溶性血管内皮生长因子受体1   英文名称
：   Human Soluble Fms-like Tyrosine Kinase 1/sVEGFR1   规格：      英文缩写：   SFLT1