ELISA 是以免疫學反應為基礎 ，將抗原 、抗體的特異性反應與酶對底物的催化作用相結合起來的一種敏感性很高的試驗技術 。免疫酶技術是將酶標記在抗體/抗原分子上 ，形成酶標抗體/酶標抗原 ，稱為酶結合物 。該酶結合物的酶在免疫反應後 ，作用於底物使之呈色，根據顏色的有無和深淺 ，定位或定量抗原/抗體 。ELISA 法是免疫酶技術的一種 ，其特點是利用聚苯乙烯微量反應板(或球)吸附抗原/抗體 ，使之固相化 ，免疫反應和酶促反應都在其中進行 。在每次反應後都要反複洗滌 ，這既保證了反應的定量關係 ，也避免了末反應的遊離抗體/抗原的分離步驟 。在ELISA 法中.酶促反應隻進行一次 ，而抗原 、抗體的免疫反應可進行一次或數次 ，即可用二抗(抗抗體) 、三抗再次進行免疫反應 。

目前常用的幾種ELISA 方法有：測定抗體的間接法 ，測定抗原的雙抗體夾心法和測定抗原的競爭法等 。本實驗采用間接法測定單克隆抗體效價 。其主要過程為 ：首先將已知定量抗原吸附在聚苯乙烯微量反應板的凹孔內 ，加待測抗體 ，保溫後洗滌以除去未結合的雜蛋白質 ，加酶標抗抗體，保溫後洗滌 ，加底物保溫30分鍾後 ，加酸或堿終止酶促反應 ，用目測或光電比色測定抗體含量 。

   儀器 、原料和試劑

儀器

聚苯乙烯96孔酶標板 、微量移液管 、酶聯免疫閱讀儀 、水浴鍋 。

原料

單克隆抗體

試劑

1. 抗原及酶標記抗體

①抗原 ：兔抗人IgG(Rabbit Aanti-human IgG ，Code No.A0423);

②酶標抗抗體 ：兔抗鼠IgG-HRP(Rabbit Anti-mouse IgG-HRP ，Code No.P0260);均為

DAKO 公司產品 ，使用時按照說明書要求稀釋 。

4. 洗滌液(含0.05%Tween 20的PBS) ：1LPBS 中加入Tween-20 500μL 。

5. 封閉液(含1%牛血清白蛋白 ，0.1%Tween 20的PBS) ：10mLPBS 中加入100mgBSA ，10μLTween-20 。

6. 底物溶液

①緩衝液(0.1mol/LpH6.0) ：稱Na2HPO4·12H2O2.2g ，NaH2PO4·2H2O 6.84g ，用蒸餾水溶解 ，定容至500mL。

② TMB 貯液 ：稱60mgTMB 溶於10mL 二甲基亞碸中 ，4℃避光保存 。

③底物應用液：現用現配 ，磷酸鈉緩衝液10mL ，TNB 貯液10μL 。30%H2O2 15μL ，混勻 。

7. 終止液 ：2mol/LH2SO4

上一篇 酶標記物包括哪些及注意事項 下一篇 ELISA實驗看似簡單 ，其實不然