改良過碘酸鈉標記法製備酶標抗體
HRP分子中與酶活性無關的糖基被過碘酸鈉氧化為醛基 ,再與蛋白的氨基形成Schiff堿 。為了防止酶蛋白的氨基與醛基發生自身偶聯 ,在標記前先用2 ,4-二硝基氟苯(DNFB)封閉酶蛋白中殘留的a-和e-氨基 。酶與抗體的結合反應後 ,再加入硼氫化鈉還原成穩定的結合物 。
(1) 取HRP 5mg溶於0.2mol/L ,pH5.6醋酸鹽緩衝液1ml中 ,加入1%DNFB無水乙醇溶液0.1ml ,室溫下輕微攪拌1h ;
(2) 加入新鮮配置的0.1mol/L NaIO4 0.5ml ,此時溶液由原棕色變為墨綠色 ,置4℃放置30min ,此時溶液由原棕色變為墨綠色 ;
(3) 加入2.5%乙二醇1ml , 室溫下輕微攪拌1h ,終止反應 ;
(4) 加入待標記的抗體5-10mg , 用1.0mol/L , pH9.5 C ,調節pH值至9.0 ;
(5) 混勻 ,置4℃過夜
(6) 加入硼氫化鈉溶液0.1ml ,混勻 ,4℃放置3h ;
(7) 對0.01mol/L ,pH7.4 ,4℃透析過夜 ,換液3次 ;
(8) 3000r/min離心30min ,去除沉澱物 ;
(9) 收集上清液即為酶標記 。
【注意事項】
(1) 在氧化HRP時 ,以pH5.6醋酸鹽緩衝液溶解酶為宜 。
(2) 一般認為氧化HRP 5mg , NaIO4量以0.06mol/L 0.5ml為宜 ,不能低於0.015mol/L 0.5ml 。
(3) 氧化HRP時間以15-30min為宜 。
(4) 加入DNFB的目的是為了封閉酶蛋白中殘留的a-和e-氨基 。
(5) 加入乙二醇的目的是終止反應 ;為便於在加入後調pH值 ,故乙二醇要用0.05mol/L C配製 。
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