實驗報告 ：

一 、分離與培養 ：

1 、無菌條件下 ，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然後用PBS將此組織塊清洗2次 ，將組織剪成1mm3左右大小 ；

2 、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶） ，混懸10s ，置37℃條件下消化10min ，之後用滴管吹打製成單細胞懸液 ，自然沉澱並收集上清 ，用含10% FBS培養基終止消化後4℃放置 ；

3 、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液 ，混懸10s ，置37℃消化10 min後 ，按上述方法收集上清並終止消化後4℃放置 ，重複此步驟2-3次 ，直至組織被消化 ；

4 、用200目不鏽鋼篩網過濾細胞消化液 ，1200r/min 離心10min ，棄去上清 ，沉澱細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養基混懸 ，接種於25cm2培養瓶 ，放置於37℃  ，5％CO2 培養箱中培養 ；

5 、差速貼壁1h後 ，吸出培養基 ，按實驗需要接種於6孔板中繼續培養 ；二 、免疫熒光鑒定 ：

1 、待心房肌細胞生長至80%融合時 ，棄去培養基 ，用溫育的PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min ；

2 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在4℃條件下 ，用0.1％Triton X-100透膜15min ；

3 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在室溫條件下 ，用4% BSA封閉細胞30min ；

4 、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗 ，然後將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜 ；

5 、PBS衝洗細胞3次 ，每次10min ，按1 ：150的比例稀釋抗α-actin的二抗 ， 37℃條件下放置1h ；

6 、用PBS衝洗3次 ，每次10min ，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像並拍照 。

細胞簡介 ：

豬心髒瓣膜內皮分離自心髒瓣膜組織 ；心髒是脊椎動物身體中重要的一個器官 ，主要功能是為血液流動提供壓力 ，把血液運行至身體各個部分 。心髒由心肌構成 ，左心房 、左心室 、右心房 、右心室四個腔組成 。左右心房之間和左右心室之間均由間隔隔開 ，故互不相通 ，心房與心室之間有瓣膜（房室瓣） ，這些瓣膜使血液隻能由心房流入心室 ，而不能倒流 。心髒的作用是推動血液流動 ，向器官 、組織提供充足的血流量 ，以供應氧和各種營養物質 ，並帶走代謝的終產物（如二氧化碳、無機鹽 、尿素和尿酸等） ，使細胞維持正常的代謝和功能。心髒瓣膜在心髒停止的血液循環活動中扮演的角色即普通又關鍵：瓣膜相當於門衛 ，阻止血液回流於剛剛離開的心室 。在心房與心室之間 ，在心室與離開心室的血管之間 ，都有瓣膜 。血液流過後 ，瓣膜就會合上常見的瓣膜問題是二尖瓣脫垂 ，“二尖瓣"這個詞源自“主教冠" ，它是主教戴的帽子 ，有兩個尖 。位於左心房和左心室之間的瓣膜不能正常閉合 。

方法簡介 ：

公司實驗室分離的豬心髒瓣膜內皮采用-膠原酶聯合消化法結合差速貼壁法 、並通過內皮細胞專用培養基培養篩選製備而來 ，細胞總量約為5×10?cells/瓶 。

質量檢測

公司實驗室分離的豬心髒瓣膜內皮經CD31免疫熒光鑒定 ，純度可達90%以上 ，且不含有HIV-1 、HBV 、HCV 、支原體 、細菌 、酵母和真菌等 。

培養信息 ：

包被條件 PLL（0.1mg/ml） ，明膠（0.1%）

培養基 含FBS 、生長添加劑 、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細胞形態 內皮細胞樣

傳代特性 可傳2-3代

消化液 0.25%

培養條件 氣相 ：空氣 ，95% ；CO2 ，5%

注意事項 ：

1. 收到細胞後首先觀察細胞瓶是否完好 ，培養液是否有漏液 、渾濁等現象 ，若有上述現象發生請及時和老哥俱樂部聯係 。

2. 仔細閱讀細胞說明書 ，了解細胞相關信息 ，如細胞形態 、所用培養基 、血清比例 、所需細胞因子等 ，確保細胞培養條件一致 ，若由於培養條件不一致而導致細胞出現問題 ，責任由客戶自行承擔 。

3. 用75%酒精擦拭細胞瓶表麵 ，顯微鏡下觀察細胞狀態 。因運輸問題 ，部分細胞由於溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片，是正常現象 。觀察好細胞狀態後 ，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置於37℃培養箱放置4-6h 。

4. 貼壁細胞可以消化 ，懸浮細胞直接混勻收集細胞 ，900 rpm-1000 rpm離心3 min ，棄上清 。加5 mL PBS重懸細胞 ，再900 rpm-1000 rpm離心3 min ， ，用新鮮的*培養基重懸細胞 ，並接種到新的培養瓶或培養皿中 ，置於培養箱中進行培養 。

5. 請客戶用相同條件的培養基用於細胞培養 。

6. 建議客戶收到細胞後前3天各拍幾張細胞照片 ，記錄細胞狀態 ，便於和我司技術部溝通交流 。由於運輸的原因 ，個別敏感細胞會出現不穩定的情況 ，請及時和老哥俱樂部聯係 ，告知細胞的具體情況 ，以便老哥俱樂部的技術人員跟蹤回訪直至問題解決 。

7. 該細胞僅供科研使用 。

8. 備注 ：運輸用的培養基(灌液培養基)不能再用來培養細胞 ，請換用按照說明書細胞培養條件新配製的*培養基來培養細胞 。收到細胞後次傳代建議1 ：2傳代  。

9.注意 ： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿 。不是1個T25瓶傳2個10cm皿 。

公司正在出售的產品 ：

大鼠細胞周期素D3(CCND3)檢測試劑盒  ，英文名 ： CCND3 ELISA Kit

Mouse mammary carcinoma marker-ca153 -CA153ELISA 小鼠癌標誌物-CA153檢測試劑盒

MouseIerleukin1β,IL-1βELISAKit 小鼠白介素1β(IL-1β)檢測試劑盒 96T/48T 進口分裝

HSV-IIIgM單皰疹Ⅱ型病毒IgM(捕獲法 ，二步法)

細胞II型L-3羥酰基-CoA脫氫酶/β澱粉樣蛋白結合乙醇脫氫酶(HADHII/ABAD)活性比色法定量檢測試劑盒20次

ELISAKitCD44大鼠白細胞分化抗原44

GRN重組人 Granulin / GRN / Progranulin 蛋白 Protein

血管內皮細胞蛋白C受體(PROCR)重組蛋白 Recombinant Protein C Receptor, Endothelial (PROCR)

NA重組甲型流感 H1N1 (A/California/04/2009) 神經酶 (Neuraminidase / NA) (Fc 標簽) Protein

EFNA1 Protein Human 重組人 Ephrin-A1 / EFNA1 蛋白

GP140 Protein HIV 重組人類免疫缺陷病毒Ⅰ型 HIV-1 gp140 蛋白 (group M, subtype A, strain 92UG037.1) (Fc 標簽)

血管內皮細胞蛋白C受體(PROCR)重組蛋白 Recombinant Protein C Receptor, Endothelial (PROCR)

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小鼠解脲脲原體抗體(UU-Ab)ELISA 試劑盒 96T/48T

Human papilloma virus aibody (HPV) ELISA Kit 人狀瘤病毒抗體(HPV)檢測試劑盒

HumanfibromodulinELISAKit 人纖調蛋白(fibromodulin)檢測試劑盒 96T/48T 進口分裝

Humanai-cardiolipinaibodyIgA,ACA-IgA檢測試劑盒人抗心0脂抗體IgA(ACA-IgA)檢測試劑盒規格 ：96T/48T

植物核同糖1,5二0酸羧化/加氧酶(RUBPCase/Rubisco)羧化活性酶連續循環比色法定量檢測試劑盒20次

Humanα-galactoyl,GalELISAKit人α半乳糖基抗體(Gal)檢測試劑盒規格 ：96T/48T

豬心髒瓣膜內皮細胞小鼠凋亡相關因子(FAS/CD95)ELISAKit   ELISA.   96T/48T

小鼠Slit2ELISAKit   ELISA.   96T/48T

小鼠β澱粉樣蛋白1-42(Aβ1-42)ELISAKit   ELISA.   96T/48T

小鼠8羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)ELISAKit   ELISA.   96T/48T