老哥俱乐部

实验报告

：

一、分离与培养：

1
、无菌条件下
，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，将组织剪成1mm3左右大小

；

2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶）
，混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

3
、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后
，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织被消化；

4
、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min
，弃去上清
，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶

，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；

5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养
；二
、免疫荧光鉴定：

1、待心房肌细胞生长至80%融合时
，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次
，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

2、PBS冲洗细胞2次

，每次10min
，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min
；

3
、PBS冲洗细胞2次

，每次10min，然后在室温条件下
，用4% BSA封闭细胞30min
；

4
、按1: 100的比例稀释α-actin一抗
，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜
；

5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗
， 37℃条件下放置1h
；

6、用PBS冲洗3次，每次10min，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

细胞简介
：

小鼠外周血来源内皮祖分离自外周血；外周血是除骨髓之外的血液，临床上常用一些方法把骨髓中的造血干细胞释放到血液中，再在从血液中提取分离得到造血干细胞


，老哥俱乐部把这样得到的干细胞称为外周血干细胞，在二十一世纪初人类开始的生命方舟计划中提出外周血这一新概念
。内皮祖细胞是血管内皮细胞的前体细胞，亦称为成血管细胞（Angioblast），是一群具有游走特性
，能进一步增殖分化的幼稚内皮细胞
，缺乏成熟内皮细胞的特征性表型，不能形成管腔样结构，其功能主要为参与了出生后缺血组织的血管发生和血管损伤后的修复
。研究显示，内皮祖细胞在心脑血管疾病、外周血管疾病
、肿瘤血管形成及创伤愈合等方面均发挥重要作用
，并为缺血性疾病的研究治疗提供了新思路，EPCs生物学特性和治疗作用的研究成为这一领域新的热点。

方法简介
：

公司实验室分离的小鼠外周血来源内皮祖采用采集外周血
、密度梯度离心
、差速贴壁法结合内皮细胞专用培养基培养筛选制备而来，细胞总量约为5×10?cells/瓶
。

质量检测

公司实验室分离的小鼠外周血来源内皮祖经CD34免疫荧光鉴定


，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1
、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等
。

培养信息

：

包被条件 PLL（0.1mg/ml）
，明胶（0.1%）

培养基 含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等

换液频率 每2-3天换液一次

生长特性 贴壁

细胞形态 内皮细胞样

传代特性 可传1-2代；不建议多次传代

消化液 0.25%

培养条件 气相：空气，95%；CO2
，5%

注意事项
：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和老哥俱乐部联系。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息
，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致
，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态。因运输问题，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片，是正常现象。观察好细胞状态后
，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h。

4. 贴壁细胞可以消化，悬浮细胞直接混匀收集细胞
，900 rpm-1000 rpm离心3 min
，弃上清。加5 mL PBS重悬细胞
，再900 rpm-1000 rpm离心3 min，，用新鲜的*培养基重悬细胞
，并接种到新的培养瓶或培养皿中
，置于培养箱中进行培养。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养
。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片
，记录细胞状态
，便于和我司技术部沟通交流
。由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和老哥俱乐部联系，告知细胞的具体情况
，以便老哥俱乐部的技术人员跟踪回访直至问题解决。

7. 该细胞仅供科研使用。

8. 备注：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞
。收到细胞后次传代建议1：2传代 。

9.注意： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿
。不是1个T25瓶传2个10cm皿
。

公司正在出售的产品：

大鼠原肌球蛋白2β(TPM2)检测试剂盒

，英文名： TPM2 ELISA Kit

Mouse ovarian cancer marker CA125ELISA Kit 小鼠卵巢癌标志物CA125检测试剂盒

Mousemacrophageinflammatoryprotein3β,MIP-3βELISAkit 小鼠巨噬细胞性蛋白3β(MIP-3β/ELC/CCL19)检测试剂盒 96T/48T 进口分装

CLIAKitforHumanEsogen-inducedproteinpS2ELISAKit人雌激素诱导蛋白PS2

细胞/组织线粒体DNA萃取试剂盒10次

ELISAKitMYO/MB大鼠肌红蛋白

PDPN重组小鼠 Podoplanin / PDPN 蛋白 Protein

白介素9(IL9)重组蛋白 Recombinant Interleukin 9 (IL9)

DUSP3重组人 DUSP3 / VHR 蛋白 Protein

DDOST Protein Human 重组人 DDOST / OST48 蛋白

THY1 Protein Cynomolgus 重组食蟹猴 CD90 / THY-1 蛋白

Annexin II 膜粘连蛋白-2抗原 0.5mgAnnexin II 膜粘连蛋白-2抗原

DDOST Protein Human 重组人 DDOST / OST48 蛋白

F2重组小鼠 Coagulation Factor II / FII / F2 蛋白 Protein

CD59 Protein Rat 重组大鼠 CD59 / CD59A / MAC / IP 蛋白

MSN重组人 MSN / Moesin 蛋白 (aa 1-346, His 标签) Protein

小鼠可溶性肌球蛋白重链1(sMHC-1)Elisa 试剂盒 96T/48T

Rat macrophage inflammatory protein 3 alpha (MIP-3 alpha /CCL20) ELISA Kit 大鼠巨噬细胞性蛋白3α(MIP-3α/CCL20)检测试剂盒

HumanFibrinogenlikepeptide2,fgl2ELISAKit 人纤维介素蛋白(fgl2)检测试剂盒 96T/48T 进口分装

Humanaldehydedehydrogenase,ALDH检测试剂盒人乙脱氢酶(ALDH)检测试剂盒规格
：96T/48T

植物P型氢ATP酶(H+-ATPase)活性比色法定量检测试剂盒20次

Mouse6-keto-prostaglandin,6-K-PGELISAKit小鼠6同前列腺素(6-K-PG)检测试剂盒规格：96T/48T

小鼠外周血来源内皮祖细胞小鼠肌红蛋白检测试剂盒   小鼠肌红蛋白试剂盒   规格型号：96T/48T   小鼠肌红蛋白试剂盒，规格型号：96T/48T，来源：检测试剂盒（进口分装），产品别名
：小鼠肌红蛋白试剂盒
、小鼠肌红蛋白eisa试剂盒   保存条件：2-8℃   保质期：6个月。

小鼠肌肝检测试剂盒   小鼠肌肝试剂盒   规格型号：96T/48T   小鼠肌肝试剂盒，规格型号：96T/48T
，来源：检测试剂盒（进口分装）
，产品别名：小鼠肌肝试剂盒、小鼠肌肝eisa试剂盒   保存条件
：2-8℃   保质期
：6个月。

小鼠肌钙蛋白检测试剂盒   小鼠肌钙蛋白试剂盒   规格型号
：96T/48T   小鼠肌钙蛋白试剂盒，规格型号：96T/48T
，来源：检测试剂盒（进口分装），产品别名：小鼠肌钙蛋白试剂盒
、小鼠肌钙蛋白eisa试剂盒   保存条件：2-8℃   保质期：6个月。

小鼠活化蛋白检测试剂盒   小鼠活化蛋白试剂盒   规格型号：96T/48T   小鼠活化蛋白试剂盒

，规格型号
：96T/48T

，来源：检测试剂盒（进口分装），产品别名
：小鼠活化蛋白试剂盒、小鼠活化蛋白eisa试剂盒   保存条件
：2-8℃   保质期
：6个月。