實驗報告 ：

一 、分離與培養 ：

1 、無菌條件下 ，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織 ，然後用PBS將此組織塊清洗2次 ，將組織剪成1mm3左右大小 ；

2 、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶） ，混懸10s ，置37℃條件下消化10min ，之後用滴管吹打製成單細胞懸液 ，自然沉澱並收集上清，用含10% FBS培養基終止消化後4℃放置 ；

3 、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液 ，混懸10s ，置37℃消化10 min後 ，按上述方法收集上清並終止消化後4℃放置 ，重複此步驟2-3次 ，直至組織被消化 ；

4 、用200目不鏽鋼篩網過濾細胞消化液 ，1200r/min 離心10min ，棄去上清 ，沉澱細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養基混懸，接種於25cm2培養瓶 ，放置於37℃  ，5％CO2 培養箱中培養 ；

5 、差速貼壁1h後 ，吸出培養基 ，按實驗需要接種於6孔板中繼續培養 ；二 、免疫熒光鑒定 ：

1 、待心房肌細胞生長至80%融合時 ，棄去培養基，用溫育的PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min ；

2 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在4℃條件下 ，用0.1％Triton X-100透膜15min ；

3 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在室溫條件下 ，用4% BSA封閉細胞30min ；

4 、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗 ，然後將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜 ；

5 、PBS衝洗細胞3次 ，每次10min ，按1 ：150的比例稀釋抗α-actin的二抗 ， 37℃條件下放置1h ；

6 、用PBS衝洗3次 ，每次10min ，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像並拍照 。

細胞簡介 ：

小鼠視網膜微血管內皮分離自視網膜組織 ；視網膜居於眼球壁的內層 ，是一層透明的薄膜 。視網膜由色素上皮層和視網膜感覺層組成 ，兩層間在病理情況下可分開 ，稱為視網膜脫離 。色素上皮層與脈絡膜緊密相連 ，由色素上皮細胞組成 ，它們具有支持和營養光感受器細胞 、遮光 、散熱以及再生和修複等作用 。組織學上視網膜分為10層 ，由外向內分別為 ：色素上皮層 、視錐 、視杆細胞層 、外界膜 、外顆粒層 、外叢狀層 、內顆粒層 、內叢狀層 、神經節細胞層 、神經纖維層 、內界膜 。視網膜內層為襯於血管膜內麵的一層薄膜 ，有感光作用 ；後部鼻側有一視神經乳頭 。視網膜上的感覺層是由三個神經元組成 。神經元是視細胞層 ，專司感光 ，它包括錐細胞和杆細胞 。視杆細胞主要在離中心凹較遠的視網膜上 ，而視錐細胞則在中心凹處多 。層叫雙節細胞 ，約有10到數百個視細胞通過雙節細胞與一個神經節細胞相聯係 ，負責聯絡作用 。第三層叫節細胞層 ，專管傳導 。視網膜是一層菲薄的但又非常複雜的結構 ，它貼於眼球的後壁部 ，傳遞來自視網膜感受器衝動的神經纖維跨越視網膜表麵 ，經由視神經到達出口 。視網膜的分辨力是不均勻的 ，在黃斑區 ，其分辨能力強 。它是組成血管腔麵單層扁平上皮樣細胞 ，它所產生和分泌的生物活性物質對維持血管張力 、調節血壓 、抗血栓形成等有重要作用 ，在視網膜血管疾病的發病機製中有重要病理生理學意義 。由於從不同的組織和器官獲得的內皮細胞具有不同的特性 ，在腦和視網膜中 ，這些內皮細胞具有內屏障的功能，在調節血管生理狀態 ，釋放血管活性物質以及新生血管的形成中發揮著重要作用 ，體外分離培養RCEC對研究視網膜血管性疾病發生發展的病理生理機製以及疾病的早期防治具有重要臨床意義 。

方法簡介 ：

公司實驗室分離的小鼠視網膜微血管內皮采用膠原酶-混合消化法結合密度梯度離心法 、後通過內皮細胞專用培養基培養篩選製備而來 ，細胞總量約為5×10?cells/瓶 。

質量檢測

公司實驗室分離的小鼠視網膜微血管內皮經CD31免疫熒光鑒定 ，純度可達90%以上 ，且不含有HIV-1 、HBV 、HCV 、支原體 、細菌 、酵母和真菌等 。

培養信息 ：

包被條件 PLL（0.1mg/ml） ，明膠（0.1%）

培養基 含FBS 、生長添加劑 、Penicillin 、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細胞形態 內皮細胞樣

傳代特性 可傳2-3代

消化液 0.25%

培養條件 氣相 ：空氣 ，95% ；CO2 ，5%

注意事項 ：

1. 收到細胞後首先觀察細胞瓶是否完好 ，培養液是否有漏液 、渾濁等現象 ，若有上述現象發生請及時和老哥俱樂部聯係 。

2. 仔細閱讀細胞說明書 ，了解細胞相關信息 ，如細胞形態 、所用培養基 、血清比例 、所需細胞因子等 ，確保細胞培養條件一致 ，若由於培養條件不一致而導致細胞出現問題 ，責任由客戶自行承擔 。

3. 用75%酒精擦拭細胞瓶表麵 ，顯微鏡下觀察細胞狀態 。因運輸問題 ，部分細胞由於溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片 ，是正常現象 。觀察好細胞狀態後 ，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置於37℃培養箱放置4-6h 。

4. 貼壁細胞可以消化 ，懸浮細胞直接混勻收集細胞 ，900 rpm-1000 rpm離心3 min ，棄上清 。加5 mL PBS重懸細胞 ，再900 rpm-1000 rpm離心3 min ， ，用新鮮的*培養基重懸細胞 ，並接種到新的培養瓶或培養皿中 ，置於培養箱中進行培養 。

5. 請客戶用相同條件的培養基用於細胞培養 。

6. 建議客戶收到細胞後前3天各拍幾張細胞照片 ，記錄細胞狀態 ，便於和我司技術部溝通交流 。由於運輸的原因 ，個別敏感細胞會出現不穩定的情況 ，請及時和老哥俱樂部聯係，告知細胞的具體情況 ，以便老哥俱樂部的技術人員跟蹤回訪直至問題解決 。

7. 該細胞僅供科研使用。

8. 備注 ：運輸用的培養基(灌液培養基)不能再用來培養細胞 ，請換用按照說明書細胞培養條件新配製的*培養基來培養細胞 。收到細胞後次傳代建議1 ：2傳代  。

9.注意 ： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿 。不是1個T25瓶傳2個10cm皿 。

公司正在出售的產品 ：

小鼠脂蛋白脂酶(LPL)ELISAKit   ELISA.   96T/48T

小鼠抗酸性0酸酶5b(ACP-5b)ELISAKit   ELISA.   96T/48T

中文名稱   方法   規格

小鼠葡萄糖依賴性胰島素釋放多肽(GIP)ELISAKit   ELISA.   96T/48T

小鼠血小板因子3(PF-3)ELISA 試劑盒 96T/48T

Human soluble ansferrin receptor (sTfR) ELISA Kit 人可溶性轉鐵蛋白受體(sTfR)試劑盒

Human5-Nucleotidase,5-ELISAKit 人5核苷酸酶(5-)試劑盒 96T/48T 進口分裝

(pIKBAlpha)ELISAKit大鼠0酸化核因子κB抑製蛋白α

飲料糖精(saccharin)含量紅外光譜法定量試劑盒20次

Mouseisletcellaibody,ICAELISAKit小鼠胰島細胞抗體(ICA)試劑盒規格 ：96T/48T

REG4重組小鼠 REG4 / GISP / RELP 蛋白 Protein

AMACR/P504S(alpha-methylacyl-CoA racemase 0.5mgAMACR/P504S(alpha-methylacyl-CoA racemase) α-甲基酰基消旋酶抗原

IL36A重組人 IL1F6 / IL36 蛋白 (aa 6-158) Protein

CD276 Protein Human 重組人 B7-H3 / CD276 蛋白

TNFSF15 Protein Rat 重組大鼠 TNFSF15 / TL1A 蛋白 (Fc 標簽)

AMACR/P504S(alpha-methylacyl-CoA racemase 0.5mgAMACR/P504S(alpha-methylacyl-CoA racemase) α-甲基酰基消旋酶抗原

CD276 Protein Human 重組人 B7-H3 / CD276 蛋白

REG4重組小鼠 REG4 / GISP / RELP 蛋白 Protein

TNFSF15 Protein Rat 重組大鼠 TNFSF15 / TL1A 蛋白 (Fc 標簽)

IL36A重組人 IL1F6 / IL36 蛋白 (aa 6-158) Protein

小鼠視網膜微血管內皮細胞大鼠頂體蛋白(ACR)試劑盒  ，英文名 ： ACR ELISA Kit

Porcine growth hormone releasing peptide GHR 豬生長激素釋放肽ghr

木瓜特定基因序列(Papaya)核酸試劑盒(PCR-熒光探針法) 48T

CLIAKitforLTB4(HumanLeukoieneB4)ELISAKit人白三烯B4

體液組織蛋白酶B(CATHEPSINB)活性熒光定量試劑盒20次

ELISAKitHsp-60雞熱休克蛋白60