實驗報告 ：

一 、分離與培養 ：

1 、無菌條件下 ，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織 ，然後用PBS將此組織塊清洗2次 ，將組織剪成1mm3左右大小 ；

2 、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s ，置37℃條件下消化10min ，之後用滴管吹打製成單細胞懸液 ，自然沉澱並收集上清 ，用含10% FBS培養基終止消化後4℃放置 ；

3 、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液 ，混懸10s ，置37℃消化10 min後 ，按上述方法收集上清並終止消化後4℃放置 ，重複此步驟2-3次 ，直至組織被消化 ；

4 、用200目不鏽鋼篩網過濾細胞消化液 ，1200r/min 離心10min ，棄去上清 ，沉澱細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養基混懸 ，接種於25cm2培養瓶 ，放置於37℃  ，5％CO2 培養箱中培養 ；

5 、差速貼壁1h後 ，吸出培養基 ，按實驗需要接種於6孔板中繼續培養 ；二 、免疫熒光鑒定 ：

1、待心房肌細胞生長至80%融合時 ，棄去培養基 ，用溫育的PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min ；

2 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在4℃條件下 ，用0.1％Triton X-100透膜15min ；

3 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在室溫條件下 ，用4% BSA封閉細胞30min ；

4 、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗 ，然後將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜 ；

5 、PBS衝洗細胞3次 ，每次10min ，按1 ：150的比例稀釋抗α-actin的二抗 ， 37℃條件下放置1h ；

6 、用PBS衝洗3次 ，每次10min ，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像並拍照 。

細胞簡介 ：

小鼠呼吸道上皮分離自呼吸道 ；呼吸道是肺呼吸時氣流所經過的通道 ，有肺脊椎動物的呼吸道分上 、下兩部 ：鼻 、咽和喉合稱上呼吸道 。氣管及其以後一分再分的管道 ，合稱為下呼吸道 ，或稱為氣管樹 。氣管樹是隨著動物的進化逐漸複雜化的 。整個呼吸道內表麵都分布有分泌液和纖毛（鼻孔 、咽後壁和聲帶黏膜除外） ，它能溫暖（或冷卻） 、濕潤和淨化吸入的空氣 ，對於呼吸器官和機體有著保護作用 。呼吸道以骨或軟骨做支架 ，其內表麵覆蓋著黏膜 ，黏膜內分布著豐富的毛細血管 。呼吸道上皮細胞屬於假複層纖毛柱狀上皮 ，分布於呼吸道的內表麵 ，主要由柱狀 ，杯形 ，梭形和錐形等不同形狀細胞組成 。看上去像複層上皮 ，但實際上所有細胞底部均附於基膜上 ，屬單層上皮 ，故稱假複層柱狀上皮 ，上皮表麵有纖毛 ，杯狀細胞可分泌粘液 ，包裹著大量細菌 ，借助纖毛不斷擺動將其慢慢移動至出消化道 。

方法簡介 ：

公司實驗室分離的小鼠呼吸道上皮采用-膠原酶混合消化法結合差速貼壁法 ，並通過上皮細胞專用培養基培養篩選製備而來 ，細胞總量約為5×10?cells/瓶 。

質量檢測

公司實驗室分離的小鼠呼吸道上皮經PCK免疫熒光鑒定 ，純度可達90%以上 ，且不含有HIV-1 、HBV 、HCV 、支原體 、細菌 、酵母和真菌等 。

培養信息 ：

包被條件 鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培養基 含FBS 、生長添加劑 、Penicillin 、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細胞形態 上皮細胞樣

傳代特性 可傳1-2代

消化液 0.25%

培養條件 氣相 ：空氣 ，95% ；CO2 ，5%

注意事項：

1. 收到細胞後首先觀察細胞瓶是否完好 ，培養液是否有漏液 、渾濁等現象 ，若有上述現象發生請及時和老哥俱樂部聯係 。

2. 仔細閱讀細胞說明書 ，了解細胞相關信息 ，如細胞形態 、所用培養基 、血清比例 、所需細胞因子等 ，確保細胞培養條件一致 ，若由於培養條件不一致而導致細胞出現問題 ，責任由客戶自行承擔 。

3. 用75%酒精擦拭細胞瓶表麵 ，顯微鏡下觀察細胞狀態 。因運輸問題 ，部分細胞由於溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片 ，是正常現象 。觀察好細胞狀態後 ，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置於37℃培養箱放置4-6h 。

4. 貼壁細胞可以消化，懸浮細胞直接混勻收集細胞 ，900 rpm-1000 rpm離心3 min ，棄上清 。加5 mL PBS重懸細胞 ，再900 rpm-1000 rpm離心3 min ， ，用新鮮的*培養基重懸細胞 ，並接種到新的培養瓶或培養皿中 ，置於培養箱中進行培養 。

5. 請客戶用相同條件的培養基用於細胞培養 。

6. 建議客戶收到細胞後前3天各拍幾張細胞照片 ，記錄細胞狀態 ，便於和我司技術部溝通交流 。由於運輸的原因 ，個別敏感細胞會出現不穩定的情況 ，請及時和老哥俱樂部聯係 ，告知細胞的具體情況 ，以便老哥俱樂部的技術人員跟蹤回訪直至問題解決 。

7. 該細胞僅供科研使用 。

8. 備注 ：運輸用的培養基(灌液培養基)不能再用來培養細胞，請換用按照說明書細胞培養條件新配製的*培養基來培養細胞 。收到細胞後次傳代建議1 ：2傳代  。

9.注意 ： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿 。不是1個T25瓶傳2個10cm皿 。

公司正在出售的產品 ：

大鼠I型膠原(COL1)檢測試劑盒  ，英文名 ： COL1 ELISA Kit

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ELISA 小鼠血小板生成素(mouse TPO)  進口分裝

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TSPAN7重組人 TALLA-1 / TSPAN7 蛋白 Protein

CSNK2A2 Protein Human 重組人 CSNK2A2 / CK2A2 蛋白 (His & GST 標簽)

IL17A Protein Marmoset 重組絨猴 IL17 / IL17A 蛋白

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CSNK2A2 Protein Human 重組人 CSNK2A2 / CK2A2 蛋白 (His & GST 標簽)

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IL17A Protein Marmoset 重組絨猴 IL17 / IL17A 蛋白

TSPAN7重組人 TALLA-1 / TSPAN7 蛋白 Protein

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Rat thyroid peroxidase (TPO) ELISA Kit 大鼠甲狀腺過氧化物酶(TPO)檢測試劑盒

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