老哥俱乐部

实验报告：

一、分离与培养
：

1
、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次
，将组织剪成1mm3左右大小
；

2
、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液
，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次

，直至组织被消化
；

4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养

；

5
、差速贴壁1h后，吸出培养基

，按实验需要接种于6孔板中继续培养
；二、免疫荧光鉴定：

1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

2、PBS冲洗细胞2次，每次10min
，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS冲洗细胞2次

，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；

4
、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜
；

5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；

6、用PBS冲洗3次
，每次10min
，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照
。

细胞简介：

兔直肠黏膜上皮分离自直肠组织；直肠为大肠的未段，位于小骨盆内


。上端平第3骶椎处接续乙状结肠，沿骶骨和尾骨的前面下行，穿过盆膈
，下端以门而终。直肠上端的大小似结肠
，其下端扩大成直肠壶腹
，是粪便排出前的暂存部位

，下端变细接管
。直肠在盆腔内的位置与骶椎腹面关系密切，与骶椎有相同的曲度。直肠周围多脂肪
、无纵带
，位于膀胱和生殖器官的背侧。直肠的动脉血供主要是来自肠系膜下动脉的直肠上动脉，来自髂内动脉的直肠中动脉和来自髂内动脉的直肠下动脉。肠黏膜上皮细胞是机体内外环境的重要屏障
，持续暴露于大量抗原中，也是机体面对病原微生物的道防线。因此，肠黏膜上皮细胞除有吸收、分泌和转运等重要生理功能之外，在黏膜先天性和获得性免疫防御机制中也起着重要作用。肠黏膜上皮细胞作为先接触抗原的细胞

，在黏膜免疫反应的起始阶段发挥关键作用，它决定黏膜免疫反应的发生、性质和强度。

方法简介：

实验室分离的兔直肠黏膜上皮采用先机械分离法、后胶原酶消化法并通过上皮细胞专用培养基培养筛选制备而来，细胞总量约为5×10⁵cells/瓶。

质量检测

实验室分离的兔直肠黏膜上皮经Cytokeratin-18免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上
，且不含有HIV-1、HBV
、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养信息：

包被条件：鼠尾胶原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培养基

：含FBS、生长添加剂
、Penicillin、Streptomycin等

换液频率：每2-3天换液一次

生长特性
：贴壁

细胞形态：上皮细胞样

传代特性
：可传1-2代

消化液
：0.25%

培养条件：气相：空气
，95%；CO2
，5%

兔直肠黏膜上皮体外培养周期有限
；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的佳培养状态。

注意事项：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好
，培养液是否有漏液、浑浊等现象

，若有上述现象发生请及时和老哥俱乐部联系。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息
，如细胞形态、所用培养基

、血清比例
、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致
，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题
，责任由客户自行承担。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态
。因运输问题，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片，是正常现象。观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h
。

4. 贴壁细胞可以消化
，悬浮细胞直接混匀收集细胞，900 rpm-1000 rpm离心3 min，弃上清
。加5 mL PBS重悬细胞，再900 rpm-1000 rpm离心3 min，，用新鲜的*培养基重悬细胞，并接种到新的培养瓶或培养皿中，置于培养箱中进行培养。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养
。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片
，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流。由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况
，请及时和老哥俱乐部联系
，告知细胞的具体情况
，以便老哥俱乐部的技术人员跟踪回访直至问题解决。

7. 该细胞仅供科研使用

。

8. 备注：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞
，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞。收到细胞后次传代建议1
：2传代
。

9.注意
： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿
。不是1个T25瓶传2个10cm皿。

公司正在出售的产品
：

大鼠β防御素(β-Defensin)检测试剂盒 ，英文名： β-Defensin ELISA Kit

Mouse thyroopin releasing hormone (H) ELISA Kit 小鼠促甲状腺素释放激素(H)检测试剂盒

ELISA 小鼠8-羟基脱氧8-OHdG鸟苷酸(mouse 8-OHdG)  进口分装

CLIAKitforIL-10(RabbitIerleukin10)ELISAKit兔白介素10

通用型密执岁棍状杆菌(Clavibactermichiganensissubsp.michiganenesis;Cmm)试剂盒20次

ELISAKitVEGF-B大鼠血管内皮细胞生长因子B

CSF2重组大鼠 GM-CSF / CSF2 蛋白 (Fc 标签) Protein

cx3cl1(chemokine (C-X3-C motif 0.5mgcx3cl1(chemokine (C-X3-C motif) ligand 1) 趋化因子(C-X3-C 基元)配体1抗原

LGALS3重组人 Galectin-3 / LGALS3 蛋白 Protein

COLGALT2 Protein Human 重组人 GLT25D2 蛋白

VSIG4 Protein Mouse 重组小鼠 VSIG4 蛋白

cx3cl1(chemokine (C-X3-C motif 0.5mgcx3cl1(chemokine (C-X3-C motif) ligand 1) 趋化因子(C-X3-C 基元)配体1抗原

COLGALT2 Protein Human 重组人 GLT25D2 蛋白

CSF2重组大鼠 GM-CSF / CSF2 蛋白 (Fc 标签) Protein

VSIG4 Protein Mouse 重组小鼠 VSIG4 蛋白

LGALS3重组人 Galectin-3 / LGALS3 蛋白 Protein

小鼠色素上皮衍生因子(PEDF)ELISA 试剂盒 96T/48T

Human endotoxin (ET) ELISA Kit 人内毒素(ET)检测试剂盒

HumanαLactalbumin,α-LaELISAKit 人α乳清蛋白(α-La)检测试剂盒 96T/48T 进口分装

GoatTumornecrosisfactorα,TNF-α检测试剂盒山羊坏死因子α(TNF-α)检测试剂盒规格：96T/48T

真菌/酵母0脂酶D(PhospholipaseD)总活性荧光定量检测试剂盒20次

MouseClusterofdiffereiation19,CD19ELISAKit小鼠CD19分子(CD19)检测试剂盒规格：96T/48T

兔直肠黏膜上皮细胞小鼠膀胱抗原(BTA)检测试剂盒   96T/48T   试剂盒   组装/原装

小鼠半乳糖6酯酶(Gal-6S)检测试剂盒   96T/48T   试剂盒   组装/原装

小鼠半胱酸蛋白酶抑制剂/胱抑素C(Cys-C)检测试剂盒   96T/48T   试剂盒   组装/原装

小鼠白血病抑制因子受体(LIFR)检测试剂盒   96T/48T   试剂盒   组装/原装