實驗報告 ：

一 、分離與培養 ：

1 、無菌條件下 ，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織 ，然後用PBS將此組織塊清洗2次 ，將組織剪成1mm3左右大小 ；

2 、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶） ，混懸10s ，置37℃條件下消化10min ，之後用滴管吹打製成單細胞懸液 ，自然沉澱並收集上清 ，用含10% FBS培養基終止消化後4℃放置 ；

3 、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液 ，混懸10s ，置37℃消化10 min後 ，按上述方法收集上清並終止消化後4℃放置 ，重複此步驟2-3次 ，直至組織被消化 ；

4 、用200目不鏽鋼篩網過濾細胞消化液 ，1200r/min 離心10min ，棄去上清 ，沉澱細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養基混懸 ，接種於25cm2培養瓶 ，放置於37℃  ，5％CO2 培養箱中培養 ；

5 、差速貼壁1h後 ，吸出培養基 ，按實驗需要接種於6孔板中繼續培養 ；二 、免疫熒光鑒定 ：

1 、待心房肌細胞生長至80%融合時 ，棄去培養基 ，用溫育的PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min ；

2 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在4℃條件下 ，用0.1％Triton X-100透膜15min ；

3 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在室溫條件下 ，用4% BSA封閉細胞30min ；

4 、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗 ，然後將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜 ；

5 、PBS衝洗細胞3次 ，每次10min ，按1 ：150的比例稀釋抗α-actin的二抗 ， 37℃條件下放置1h ；

6 、用PBS衝洗3次 ，每次10min ，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像並拍照 。

細胞簡介 ：

兔胚胎羊膜分離自羊膜組織 ；羊膜為單層上皮細胞互相連接構成的薄膜 。單層上皮細胞具有分泌羊水的作用 。隨著胚胎的生長發育 ，羊膜與絨毛密切緊貼 ，形成胎膜 。胎膜隨著羊膜腔逐漸擴大而呈半透明的薄膜 ，無血管 ，富有韌性（胎膜也就是羊膜腔的囊壁） 。羊膜腔內充滿的液體為羊水 。羊膜僅覆蓋在胎盤的兒體麵 ，並不深入胎盤組織中 ，隨著妊娠的進展羊膜腔逐漸擴大 ，占據整個子宮腔 ，羊膜是胎膜內一層 ，是一層半透明的薄膜 ，與覆蓋在胎盤 、臍帶的羊膜層相連接 。羊膜是胎盤的內層 ，與人眼結膜組織結構相似 ，含有眼表上皮細胞 ，包括結膜細胞和角膜上皮細胞生長所需要的物質 ，其光滑 ，無血管 、神經及淋巴 ，具有一定的彈性 ，厚0.02~0.5mm ，在電鏡下 ，其分為五層 ：上皮層 、基底膜 、致密層 、纖維母細胞層和海綿層 ，羊膜基底膜和羊膜基質層含有大量不同的膠元 ，主要為i 、iii 、iv 、v 、vii型膠原和纖維粘連蛋白 、層粘連蛋白等成份 ，正是這些成份使羊膜可以充當“移植的基底膜"而發揮一種新的健康合適的基質 。羊膜細胞主要由羊膜上皮細胞和羊膜間充質細胞組成 ，均具有多分化潛能 ，可轉化為神經元 ，且還有合成 、釋放生物活性物質和神經營養因子的功能 。

方法簡介 ：

公司實驗室分離的兔羊膜胚胎采用-膠原酶聯合消化法製備而來製備而來 ，細胞總量約為5×10?cells/瓶 。

質量檢測

公司實驗室分離的兔羊膜胚胎經Cytokeratin-18免疫熒光鑒定 ，純度可達90%以上 ，且不含有HIV-1 、HBV 、HCV 、支原體 、細菌 、酵母和真菌等 。

培養信息 ：

包被條件 PLL（0.1mg/ml）

培養基 含FBS 、生長添加劑 、Penicillin 、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細胞形態 成纖維細胞樣

傳代特性 可傳3-5代左右

消化液 0.25%

培養條件 氣相 ：空氣 ，95% ；CO2，5%

注意事項 ：

1. 收到細胞後首先觀察細胞瓶是否完好 ，培養液是否有漏液、渾濁等現象 ，若有上述現象發生請及時和老哥俱樂部聯係 。

2. 仔細閱讀細胞說明書 ，了解細胞相關信息 ，如細胞形態 、所用培養基 、血清比例 、所需細胞因子等 ，確保細胞培養條件一致 ，若由於培養條件不一致而導致細胞出現問題 ，責任由客戶自行承擔 。

3. 用75%酒精擦拭細胞瓶表麵 ，顯微鏡下觀察細胞狀態 。因運輸問題 ，部分細胞由於溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片 ，是正常現象 。觀察好細胞狀態後 ，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置於37℃培養箱放置4-6h 。

4. 貼壁細胞可以消化 ，懸浮細胞直接混勻收集細胞 ，900 rpm-1000 rpm離心3 min，棄上清 。加5 mL PBS重懸細胞，再900 rpm-1000 rpm離心3 min ， ，用新鮮的*培養基重懸細胞 ，並接種到新的培養瓶或培養皿中 ，置於培養箱中進行培養 。

5. 請客戶用相同條件的培養基用於細胞培養 。

6. 建議客戶收到細胞後前3天各拍幾張細胞照片 ，記錄細胞狀態 ，便於和我司技術部溝通交流 。由於運輸的原因 ，個別敏感細胞會出現不穩定的情況 ，請及時和老哥俱樂部聯係 ，告知細胞的具體情況 ，以便老哥俱樂部的技術人員跟蹤回訪直至問題解決。

7. 該細胞僅供科研使用 。

8. 備注 ：運輸用的培養基(灌液培養基)不能再用來培養細胞 ，請換用按照說明書細胞培養條件新配製的*培養基來培養細胞 。收到細胞後次傳代建議1 ：2傳代  。

9.注意 ： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿 。不是1個T25瓶傳2個10cm皿 。

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