實驗報告 ：

一 、分離與培養 ：

1、無菌條件下 ，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織 ，然後用PBS將此組織塊清洗2次 ，將組織剪成1mm3左右大小 ；

2 、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶） ，混懸10s ，置37℃條件下消化10min ，之後用滴管吹打製成單細胞懸液 ，自然沉澱並收集上清 ，用含10% FBS培養基終止消化後4℃放置 ；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液 ，混懸10s ，置37℃消化10 min後，按上述方法收集上清並終止消化後4℃放置 ，重複此步驟2-3次 ，直至組織被消化 ；

4 、用200目不鏽鋼篩網過濾細胞消化液 ，1200r/min 離心10min ，棄去上清 ，沉澱細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養基混懸 ，接種於25cm2培養瓶 ，放置於37℃  ，5％CO2 培養箱中培養 ；

5 、差速貼壁1h後 ，吸出培養基 ，按實驗需要接種於6孔板中繼續培養 ；二 、免疫熒光鑒定 ：

1 、待心房肌細胞生長至80%融合時 ，棄去培養基 ，用溫育的PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min ；

2 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在4℃條件下 ，用0.1％Triton X-100透膜15min ；

3 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在室溫條件下 ，用4% BSA封閉細胞30min ；

4 、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗 ，然後將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜 ；

5 、PBS衝洗細胞3次 ，每次10min ，按1 ：150的比例稀釋抗α-actin的二抗 ， 37℃條件下放置1h ；

6 、用PBS衝洗3次 ，每次10min ，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像並拍照 。

細胞簡介 ：

兔外周血來源內皮祖分離自外周血 ；外周血是除骨髓之外的血液 ，臨床上常用一些方法把骨髓中的造血幹細胞釋放到血液中 ，再在從血液中提取分離得到造血幹細胞 ，老哥俱樂部把這樣得到的幹細胞稱為外周血幹細胞 ，在二十一世紀初人類開始的生命方舟計劃中提出外周血這一新概念 。內皮祖細胞是血管內皮細胞的前體細胞，亦稱為成血管細胞（Angioblast） ，是一群具有遊走特性 ，能進一步增殖分化的幼稚內皮細胞 ，缺乏成熟內皮細胞的特征性表型 ，不能形成管腔樣結構 ，其功能主要為參與了出生後缺血組織的血管發生和血管損傷後的修複 。研究顯示 ，內皮祖細胞在心腦血管疾病 、外周血管疾病 、腫瘤血管形成及創傷愈合等方麵均發揮重要作用 ，並為缺血性疾病的研究治療提供了新思路 ，EPCs生物學特性和治療作用的研究成為這一領域新的熱點 。

方法簡介 ：

實驗室分離的兔外周血來源內皮祖采用采集外周血 、密度梯度離心 、差速貼壁法結合內皮細胞專用培養基培養篩選製備而來 ，細胞總量約為5×10⁵cells/瓶 。

質量檢測

實驗室分離的兔外周血來源內皮祖經CD34免疫熒光鑒定 ，純度可達90%以上 ，且不含有HIV-1 、HBV 、HCV 、支原體 、細菌 、酵母和真菌等 。

培養信息 ：

包被條件 ：PLL（0.1mg/ml） ，明膠（0.1%）

培養基 ：含FBS 、生長添加劑 、Penicillin 、Streptomycin等

換液頻率 ：每2-3天換液一次

生長特性 ：貼壁

細胞形態 ：內皮細胞樣

傳代特性 ：可傳1-2代 ；不建議多次傳代

消化液 ：0.25%

培養條件 ：氣相 ：空氣 ，95%；CO2 ，5%

兔外周血來源內皮祖體外培養周期有限 ；建議使用配套的專用生長培養基及正確的操作方法來培養 ，以此保證該細胞的佳培養狀態 。

注意事項 ：

1. 收到細胞後首先觀察細胞瓶是否完好，培養液是否有漏液 、渾濁等現象 ，若有上述現象發生請及時和老哥俱樂部聯係 。

2. 仔細閱讀細胞說明書 ，了解細胞相關信息 ，如細胞形態 、所用培養基 、血清比例 、所需細胞因子等 ，確保細胞培養條件一致 ，若由於培養條件不一致而導致細胞出現問題 ，責任由客戶自行承擔 。

3. 用75%酒精擦拭細胞瓶表麵 ，顯微鏡下觀察細胞狀態 。因運輸問題 ，部分細胞由於溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片 ，是正常現象 。觀察好細胞狀態後 ，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置於37℃培養箱放置4-6h 。

4. 貼壁細胞可以消化 ，懸浮細胞直接混勻收集細胞 ，900 rpm-1000 rpm離心3 min ，棄上清 。加5 mL PBS重懸細胞 ，再900 rpm-1000 rpm離心3 min ， ，用新鮮的*培養基重懸細胞 ，並接種到新的培養瓶或培養皿中，置於培養箱中進行培養 。

5. 請客戶用相同條件的培養基用於細胞培養 。

6. 建議客戶收到細胞後前3天各拍幾張細胞照片 ，記錄細胞狀態 ，便於和我司技術部溝通交流 。由於運輸的原因 ，個別敏感細胞會出現不穩定的情況 ，請及時和老哥俱樂部聯係 ，告知細胞的具體情況 ，以便老哥俱樂部的技術人員跟蹤回訪直至問題解決 。

7. 該細胞僅供科研使用 。

8. 備注 ：運輸用的培養基(灌液培養基)不能再用來培養細胞 ，請換用按照說明書細胞培養條件新配製的*培養基來培養細胞 。收到細胞後次傳代建議1 ：2傳代  。

9.注意 ： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿 。不是1個T25瓶傳2個10cm皿 。

公司正在出售的產品 ：

大鼠醌NADH脫氫酶1(NQO1)檢測試劑盒  ，英文名 ： NQO1 ELISA Kit

Monkey collagenase I (Collagenase I) ELISA Kit膠原酶I(Collagenase I)檢測試劑盒

Ratulasensitivethyroid-stimulatinghormone,U-TSHELISAKit 大鼠高靈敏度促甲狀腺激素(U-TSH)檢測試劑盒 96T/48T 進口分裝

CLIAKitforFT4ELISAKit大鼠遊離甲狀腺素

細胞琥珀酸脫氫酶活性染色試劑盒50次

RatpregnancyassociatedplasmaproteinA,PAPP-AELISAKit大鼠相關血漿蛋白A(PAPP-A)檢測試劑盒規格 ：96T/48T

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GLT8D2重組人 GLT8D2 蛋白 Protein

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Spike Protein MERS-CoV 中東呼吸綜合征 MERS-CoV (HCoV-EMC/2012) Spike protein fragment (RBD, aa 367-606, His 標簽)

性別決定區Y框蛋白18(SOX18)重組蛋白 Recombinant Sex Determining Region Y Box Protein 18 (SOX18)

IL10RB Protein Human 重組人 IL10Rb 蛋白

NTRK3重組人 TrkC / NTRK3 蛋白 (His & Fc 標簽) Protein

Spike Protein MERS-CoV 中東呼吸綜合征 MERS-CoV (HCoV-EMC/2012) Spike protein fragment (RBD, aa 367-606, His 標簽)

GLT8D2重組人 GLT8D2 蛋白 Protein

豚鼠心肽(ANP)檢測試劑盒  ，英文名 ： ANP ELISA Kit

Human secretory immunoglobulin A (SIgA) ELISA Kit 人分泌型免疫球蛋白A(SIgA)檢測試劑盒

rabbitbasicfibroblastgrowthfactor,bFGFELISAKit 兔子堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)檢測試劑盒 96T/48T 進口分裝

CLIAKitforBCGF(HumanBcellgrowthprotein)ELISAKit人B細胞生長因子

凝結時間(FIB)Clauss法檢測試劑盒20次

RabbitCompleme3,C3ELISAKit兔補體蛋白3(C3)檢測試劑盒規格 ：96T/48T

兔外周血來源內皮祖細胞十六烷基-二甲基-乙基  50g

CetyldimethylethylAmmoniumBromide   100g

化十六烷基   100g

CetylpyridniumChloride,Monohydrate   500g