實驗報告 ：

一 、分離與培養 ：

1 、無菌條件下 ，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織 ，然後用PBS將此組織塊清洗2次 ，將組織剪成1mm3左右大小 ；

2 、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶） ，混懸10s ，置37℃條件下消化10min ，之後用滴管吹打製成單細胞懸液 ，自然沉澱並收集上清 ，用含10% FBS培養基終止消化後4℃放置 ；

3 、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液 ，混懸10s ，置37℃消化10 min後 ，按上述方法收集上清並終止消化後4℃放置 ，重複此步驟2-3次 ，直至組織被消化 ；

4 、用200目不鏽鋼篩網過濾細胞消化液 ，1200r/min 離心10min ，棄去上清 ，沉澱細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養基混懸 ，接種於25cm2培養瓶 ，放置於37℃  ，5％CO2 培養箱中培養 ；

5 、差速貼壁1h後 ，吸出培養基 ，按實驗需要接種於6孔板中繼續培養 ；二 、免疫熒光鑒定 ：

1 、待心房肌細胞生長至80%融合時 ，棄去培養基 ，用溫育的PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min ；

2 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在4℃條件下 ，用0.1％Triton X-100透膜15min ；

3 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在室溫條件下 ，用4% BSA封閉細胞30min ；

4 、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗 ，然後將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜 ；

5 、PBS衝洗細胞3次 ，每次10min ，按1 ：150的比例稀釋抗α-actin的二抗 ， 37℃條件下放置1h ；

6 、用PBS衝洗3次 ，每次10min ，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像並拍照 。

細胞簡介 ：

兔胚胎肢芽間充質幹分離自胚胎肢芽 ；胚胎肢芽存在於兩棲類以上的大多數脊椎動物胚胎中，在四肢發生的初期階段 ，在身體兩側有呈芽狀的突起，內部是中胚層側板的體壁板壋厚形成 ，表麵有表皮覆蓋 。在這個中胚層區肢芽迅速伸長 ，不久 ，在其前端即見有指的突起 。在此時期間 ，其內部的中胚層分化成軟骨 、肌肉等 。這些分化組織 ，在將肢芽作分離培養的時候也可以獲得 。根據對兩棲類的有尾類的研究 ，作為肢原基各部的胚發能力 ，肢芽物質的大部分是位於背半部 ，而前半部主要參與基部形成 ，後半部參與前端的形成 。在實驗上 ，即使將肢的原基分成二半 ，每一半調整好都可形成基本上近於正常形態的肢體 ，而且肢體各軸的極性和側性也逐漸決定 。間充質幹細胞（MSC）是屬於中胚層的一類多能幹細胞 ，主要存在於結締組織和器官間質中 ，是具有高度自我更新和多向分化潛能的幹細胞 ；這些細胞可以通過分裂維持自身細胞的特性和數量 ，並在特定條件下轉變成為一種或多種構成機體組織或器官的細胞 ，從而在組織修複等方麵發揮積極作用 。

方法簡介 ：

實驗室分離的兔胚胎肢芽間充質幹采用-膠原酶聯合消化法製備而來 ，細胞總量約為5×10⁵cells/瓶 。

質量檢測

實驗室分離的兔胚胎肢芽間充質幹經CD90免疫熒光鑒定 ，純度可達90%以上 ，且不含有HIV-1 、HBV 、HCV 、支原體 、細菌 、酵母和真菌等 。

培養信息 ：

培養基 ：含FBS 、生長添加劑 、Penicillin 、Streptomycin等

換液頻率 ：每2-3天換液一次

生長特性 ：貼壁

細胞形態 ：成纖維細胞樣

傳代特性 ：可傳3-5代左右

消化液 ：0.25%

培養條件 ：氣相 ：空氣 ，95% ；CO2 ，5%

兔胚胎肢芽間充質幹體外培養周期有限 ；建議使用配套的專用生長培養基及正確的操作方法來培養 ，以此保證該細胞的佳培養狀態 。

注意事項 ：

1. 收到細胞後首先觀察細胞瓶是否完好 ，培養液是否有漏液 、渾濁等現象 ，若有上述現象發生請及時和老哥俱樂部聯係 。

2. 仔細閱讀細胞說明書 ，了解細胞相關信息 ，如細胞形態 、所用培養基 、血清比例 、所需細胞因子等 ，確保細胞培養條件一致 ，若由於培養條件不一致而導致細胞出現問題 ，責任由客戶自行承擔 。

3. 用75%酒精擦拭細胞瓶表麵 ，顯微鏡下觀察細胞狀態 。因運輸問題 ，部分細胞由於溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片 ，是正常現象 。觀察好細胞狀態後 ，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置於37℃培養箱放置4-6h 。

4. 貼壁細胞可以消化 ，懸浮細胞直接混勻收集細胞 ，900 rpm-1000 rpm離心3 min ，棄上清 。加5 mL PBS重懸細胞 ，再900 rpm-1000 rpm離心3 min ， ，用新鮮的*培養基重懸細胞 ，並接種到新的培養瓶或培養皿中 ，置於培養箱中進行培養 。

5. 請客戶用相同條件的培養基用於細胞培養 。

6. 建議客戶收到細胞後前3天各拍幾張細胞照片 ，記錄細胞狀態 ，便於和我司技術部溝通交流 。由於運輸的原因 ，個別敏感細胞會出現不穩定的情況 ，請及時和老哥俱樂部聯係 ，告知細胞的具體情況 ，以便老哥俱樂部的技術人員跟蹤回訪直至問題解決 。

7. 該細胞僅供科研使用 。

8. 備注 ：運輸用的培養基(灌液培養基)不能再用來培養細胞 ，請換用按照說明書細胞培養條件新配製的*培養基來培養細胞 。收到細胞後次傳代建議1 ：2傳代  。

9.注意 ： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿 。不是1個T25瓶傳2個10cm皿 。

公司正在出售的產品 ：

小鼠能a1A受體(ADRA1A)ELISA 試劑盒

Kappa aibodies to human immunoglobulin light chain (-IgLC) ELISA Kit 輕鏈kappa抗體(κ-IgLC)檢測試劑盒

HumanleucocyteaigenB27,HLA-B27ELISAKit 人類白細胞抗原B27(HLA-B27)檢測試劑盒 96T/48T 進口分裝

FishhighsensitivityC-ReactiveProtein,hs-CRP檢測試劑盒魚類超敏C反應蛋白(hs-CRP)檢測試劑盒規格 ：96T/48T

真菌/酵母蛋白巰基/結合巰基含量比色法定量檢測試劑盒20次

MouseComplemefragme3a,C3aELISAKit小鼠補體片斷3a(C3a)檢測試劑盒規格 ：96T/48T

ACE2重組食蟹猴 ACE2 / Angiotensin-Converting Enzyme 2 蛋白 Protein

Insulin protein (from porcine pancreas 0.5mgInsulin protein (from porcine pancreas) 豬胰島素

TLK1重組人 TLK1 / PKU-beta 蛋白 (His & GST 標簽) Protein

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IL36B Protein Mouse 重組小鼠 IL1F8 / IL36b 蛋白

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IL36B Protein Mouse 重組小鼠 IL1F8 / IL36b 蛋白

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豚鼠免疫球蛋白A(IgA)ELISA 試劑盒 96T/48T

Human cytotoxic T lymphocyte associated aigen 4 (CTLA-4/CD152) ELISA kit E 人細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(CTLA-4/CD152)檢測試劑盒E

Humanai-cardiolipinaibodyIgA,ACA-IgAELISAKit 人抗心0脂抗體IgA(ACA-IgA)檢測試劑盒 96T/48T 進口分裝

HumancaneousTcell-atactingchemokine,CTACK檢測試劑盒人皮膚T細胞虜獲趨化因子(CTACK/CCL27)檢測試劑盒規格 ：96T/48T

組織EPHB4激酶活性定量檢測試劑盒(A/B/C)20次

HumanProgesterone ，PROGELISAKit人孕激素/孕同(PROG)檢測試劑盒規格 ：96T/48T

兔胚胎肢芽間充質幹細胞瑞氏－姬姆薩複合染液   Vascular permeability test solion

姬姆薩染液   Peroxidase staining

巴氏染液（脫落細胞染色）   Name

快速H－E組織細胞及脫落細胞染液   Phosphate buffer