老哥俱乐部

实验报告
：

一、分离与培养
：

1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，将组织剪成1mm3左右大小
；

2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min
，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清
，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置
；

3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织被消化；

4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液
，1200r/min 离心10min，弃去上清
，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养
；

5
、差速贴壁1h后，吸出培养基
，按实验需要接种于6孔板中继续培养

；二
、免疫荧光鉴定：

1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min
；

2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下
，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS冲洗细胞2次，每次10min
，然后在室温条件下
，用4% BSA封闭细胞30min
；

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；

5、PBS冲洗细胞3次，每次10min
，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；

6
、用PBS冲洗3次
，每次10min
，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

细胞简介
：

人直肠黏膜上皮分离自直肠组织

；直肠为大肠的未段

，位于小骨盆内。上端平第3骶椎处接续乙状结肠，沿骶骨和尾骨的前面下行，穿过盆膈
，下端以门而终。直肠上端的大小似结肠，其下端扩大成直肠壶腹
，是粪便排出前的暂存部位，下端变细接管
。直肠在盆腔内的位置与骶椎腹面关系密切
，与骶椎有相同的曲度。直肠周围多脂肪、无纵带，位于膀胱和生殖器官的背侧。直肠的动脉血供主要是来自肠系膜下动脉的直肠上动脉

，来自髂内动脉的直肠中动脉和来自髂内动脉的直肠下动脉。肠黏膜上皮细胞是机体内外环境的重要屏障，持续暴露于大量抗原中，也是机体面对病原微生物的道防线
。因此，肠黏膜上皮细胞除有吸收、分泌和转运等重要生理功能之外
，在黏膜先天性和获得性免疫防御机制中也起着重要作用
。肠黏膜上皮细胞作为先接触抗原的细胞
，在黏膜免疫反应的起始阶段发挥关键作用
，它决定黏膜免疫反应的发生
、性质和强度。

方法简介：

公司实验室分离的人直肠黏膜上皮采用先机械分离法、后胶原酶消化法并通过上皮细胞专用培养基培养筛选制备而来
，细胞总量约为5×10?cells/瓶
。

质量检测

公司实验室分离的人直肠黏膜上皮经Cytokeratin-18免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1
、HBV
、HCV

、支原体、细菌、酵母和真菌等
。

培养信息：

包被条件 鼠尾胶原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培养基 含FBS
、生长添加剂

、Penicillin
、Streptomycin等

换液频率 每2-3天换液一次

生长特性 贴壁

细胞形态 上皮细胞样

传代特性 可传2-3代

消化液 0.25%

培养条件 气相：空气，95%；CO2，5%

注意事项：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液

、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和老哥俱乐部联系。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息
，如细胞形态
、所用培养基
、血清比例
、所需细胞因子等
，确保细胞培养条件一致，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担
。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面
，显微镜下观察细胞状态
。因运输问题，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片，是正常现象。观察好细胞状态后
，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h。

4. 贴壁细胞可以消化，悬浮细胞直接混匀收集细胞，900 rpm-1000 rpm离心3 min，弃上清。加5 mL PBS重悬细胞，再900 rpm-1000 rpm离心3 min，，用新鲜的*培养基重悬细胞，并接种到新的培养瓶或培养皿中，置于培养箱中进行培养。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片
，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流
。由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况
，请及时和老哥俱乐部联系，告知细胞的具体情况，以便老哥俱乐部的技术人员跟踪回访直至问题解决
。

7. 该细胞仅供科研使用。

8. 备注：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞。收到细胞后次传代建议1
：2传代 。

9.注意： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿
。不是1个T25瓶传2个10cm皿。

公司正在出售的产品：

大鼠热休克转录因子4(HSF4)检测试剂盒 ，英文名
： HSF4 ELISA Kit

Mouse vascular endothelial cell growth factor B (VEGF-B) ELISA Kit 小鼠血管内皮细胞生长因子B(VEGF-B)检测试剂盒

RatAquaporin1,AQP-1ELISAKit 大鼠水通道蛋白1(AQP-1)检测试剂盒 96T/48T 进口分装

CLIAKitforGuineapigovalbuminspecificIgG,OVAsIgGELISAKit豚鼠卵清蛋白特异性IgG

细胞长链脂酰合成酶(ACYLCOASYHETASE)活性酶连续循环比色法定量检测试剂盒20次

Ratulasensitivethyroid-stimulatinghormone,U-TSHELISAKit大鼠高灵敏度促甲状腺激素(U-TSH)检测试剂盒规格：96T/48T

IL1B重组大鼠 IL-1 beta / IL1B 蛋白 (pro form, His 标签) Protein

HO-2(Heme oxygenase 2 0.5mgHO-2(Heme oxygenase 2) 血红素氧合酶-2抗原

SGK3重组人 SGK3 / SGKL 蛋白 (His & GST 标签) Protein

CLEC6A Protein Human 重组人 CLEC4N / CLEC6A / Dectin-2 蛋白 (Fc 标签)

IL1R1 Protein Mouse 重组小鼠 IL1R1 / CD121a 蛋白

HO-2(Heme oxygenase 2 0.5mgHO-2(Heme oxygenase 2) 血红素氧合酶-2抗原

CLEC6A Protein Human 重组人 CLEC4N / CLEC6A / Dectin-2 蛋白 (Fc 标签)

IL1B重组大鼠 IL-1 beta / IL1B 蛋白 (pro form, His 标签) Protein

IL1R1 Protein Mouse 重组小鼠 IL1R1 / CD121a 蛋白

SGK3重组人 SGK3 / SGKL 蛋白 (His & GST 标签) Protein

小鼠双氢睾酮(DHT)ELISA 试剂盒 96T/48T

Measles virus (MV) ELISA Kit 人麻疹病毒(MV)检测试剂盒

Humansolublemyosinheavychain1,sMHC-1ELISAKit 人可溶性肌球蛋白重链1(sMHC-1)检测试剂盒 96T/48T 进口分装

DuckIerleukin6,IL-6检测试剂盒鸭白介素6(IL-6)检测试剂盒规格
：96T/48T

枣椰树(datepalm)培养基500毫升溶液/片剂

MouseDehydroepiandrosteroneS7,DHEA-S7ELISAKit小鼠脱氢表雄同S7(DHEA-S7)检测试剂盒规格
：96T/48T

人直肠黏膜上皮细胞小鼠神经营养素4   英文名称：   Neuroophin-4   规格
：      英文缩写：   -4

小鼠神经酸酶   英文名称：   Mouse Neidase   规格：      英文缩写：   NEU

小鼠8羟基脱氧鸟苷   英文名称
：   Mouse 8-hydroxy-2'-desoxyguanosine   规格：      英文缩写
：   8-OHDG

小鼠嗅素4   英文名称
：   Mouse Olfactomedin 4   规格：      英文缩写：   OLFM4