實驗報告 ：

一 、分離與培養 ：

1 、無菌條件下 ，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織 ，然後用PBS將此組織塊清洗2次 ，將組織剪成1mm3左右大小 ；

2 、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶） ，混懸10s ，置37℃條件下消化10min ，之後用滴管吹打製成單細胞懸液 ，自然沉澱並收集上清 ，用含10% FBS培養基終止消化後4℃放置 ；

3 、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液 ，混懸10s ，置37℃消化10 min後 ，按上述方法收集上清並終止消化後4℃放置 ，重複此步驟2-3次 ，直至組織被消化 ；

4 、用200目不鏽鋼篩網過濾細胞消化液 ，1200r/min 離心10min ，棄去上清 ，沉澱細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養基混懸 ，接種於25cm2培養瓶 ，放置於37℃  ，5％CO2 培養箱中培養 ；

5 、差速貼壁1h後 ，吸出培養基 ，按實驗需要接種於6孔板中繼續培養 ；二 、免疫熒光鑒定 ：

1 、待心房肌細胞生長至80%融合時 ，棄去培養基 ，用溫育的PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min ；

2 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在4℃條件下 ，用0.1％Triton X-100透膜15min ；

3 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在室溫條件下 ，用4% BSA封閉細胞30min ；

4 、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗 ，然後將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜 ；

5 、PBS衝洗細胞3次 ，每次10min ，按1 ：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6 、用PBS衝洗3次 ，每次10min ，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像並拍照 。

細胞簡介 ：

人軟骨分離自軟骨組織 ；軟骨組織由軟骨細胞 、基質及纖維構成 。軟骨組織再生能力強 ，這些增生的幼稚細胞形似纖維母細胞 ，以後逐漸變為軟骨母細胞，並形成軟骨基質 ，細胞被埋在軟骨陷窩內而變為靜止的軟骨細胞 。根據軟骨組織內所含纖維成分的不同 ，可將軟骨分為透明軟骨 、彈性軟骨和纖維軟骨三種 ，其中以透明軟骨的分布較廣 ，結構也較典型 。軟骨細胞（chondrocyte）位於軟骨陷窩內 。幼稚的軟骨細胞位於軟骨組織的表層 ，單個分布 ，體積較小 ，呈橢圓形 ，長軸與軟骨表麵平行 ，越向深層的軟骨細胞體積之間增大呈圓形 ，細胞核圓形或卵圓形 ，染色淺 ，細胞質弱嗜堿性 ，常見數量不一的脂滴 。成熟的軟骨細胞多2-8個成群分布於軟骨陷窩內 ，這些軟骨細胞由同一個母細胞分裂增殖而成 ，稱為同源細胞群 。電鏡下 ，軟骨細胞有突起和皺褶 ，細胞質內有大量的粗麵內質網和發達的高爾基複合體及少量的線粒體 。在組織切片中 ，軟骨細胞收縮為不規則形 ，在軟骨囊和細胞之間出現較大的腔隙 。體外培養的軟骨細胞對於研究其生理功能 、藥物作用以及各種致病因素作用下的病理生理改變具重要意義 。

方法簡介 ：

公司實驗室分離的人軟骨采用膠原酶-聯合消化製備而來 ，細胞總量約為5×10?cells/瓶 。

質量檢測

公司實驗室分離的人軟骨經Ⅱ型膠原蛋白免疫熒光鑒定 ，純度可達90%以上 ，且不含有HIV-1 、HBV 、HCV 、支原體 、細菌 、酵母和真菌等 。

培養信息 ：

培養基 含FBS 、生長添加劑、Penicillin 、Streptomycin等

換液頻率 每2~3天換液一次

生長特性 貼壁

細胞形態 梭形 、多角形

傳代特性 可傳5代左右 ；3代以內狀態佳

消化液 0.25%

培養條件 氣相 ：空氣 ，95% ；CO2 ，5%

注意事項 ：

1. 收到細胞後首先觀察細胞瓶是否完好 ，培養液是否有漏液 、渾濁等現象 ，若有上述現象發生請及時和老哥俱樂部聯係 。

2. 仔細閱讀細胞說明書 ，了解細胞相關信息 ，如細胞形態 、所用培養基 、血清比例 、所需細胞因子等 ，確保細胞培養條件一致 ，若由於培養條件不一致而導致細胞出現問題 ，責任由客戶自行承擔 。

3. 用75%酒精擦拭細胞瓶表麵 ，顯微鏡下觀察細胞狀態 。因運輸問題 ，部分細胞由於溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片 ，是正常現象。觀察好細胞狀態後 ，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置於37℃培養箱放置4-6h 。

4. 貼壁細胞可以消化 ，懸浮細胞直接混勻收集細胞 ，900 rpm-1000 rpm離心3 min ，棄上清 。加5 mL PBS重懸細胞 ，再900 rpm-1000 rpm離心3 min ， ，用新鮮的*培養基重懸細胞 ，並接種到新的培養瓶或培養皿中 ，置於培養箱中進行培養。

5. 請客戶用相同條件的培養基用於細胞培養 。

6. 建議客戶收到細胞後前3天各拍幾張細胞照片 ，記錄細胞狀態 ，便於和我司技術部溝通交流 。由於運輸的原因 ，個別敏感細胞會出現不穩定的情況 ，請及時和老哥俱樂部聯係 ，告知細胞的具體情況 ，以便老哥俱樂部的技術人員跟蹤回訪直至問題解決 。

7. 該細胞僅供科研使用 。

8. 備注 ：運輸用的培養基(灌液培養基)不能再用來培養細胞 ，請換用按照說明書細胞培養條件新配製的*培養基來培養細胞 。收到細胞後次傳代建議1 ：2傳代  。

9.注意 ： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿 。不是1個T25瓶傳2個10cm皿。

公司正在出售的產品 ：

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小鼠正常T細胞表達試劑盒   小鼠正常T細胞表達試劑盒   規格型號 ：96T/48T   小鼠正常T細胞表達試劑盒 ，規格型號 ：96T/48T ，來源 ：試劑盒（進口分裝） ，產品別名 ：小鼠正常T細胞表達試劑盒 、小鼠正常T細胞表達eisa試劑盒   保存條件 ：2-8℃   保質期 ：6個月 。

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小鼠鐵調素(Hepcidin)試劑盒 96T/48T

Rat melanocyte aibody (MC Ab) ELISA Kit 大鼠黑色素細胞抗體(MC Ab)試劑盒

HumanglycolipidaoaibodyELISAKit 人抗糖脂抗體(glycolipid)試劑盒 96T/48T 進口分裝

Chickeoxoplasmacirculatingaigen,TCA試劑盒雞弓形蟲循環抗原(TCA)試劑盒規格 ：96T/48T

載玻片細胞RHO蛋白表達熒光顯微鏡試劑盒10/20次

MousefactorB,BFELISAKit小鼠B因子(BF)試劑盒規格 ：96T/48T

LGMN重組小鼠 Legumain/ LGMN 蛋白 Protein

CK18(Cytokeratin 18 0.5mgCK18(Cytokeratin 18) 細胞角蛋白18(多肽)

PARP3重組人 PARP-3 / PARP3 蛋白 (His & GST 標簽) Protein

CFL2 Protein Human 重組人 CFL2 / cofilin 2 / ADF 蛋白

VSIG4 Protein Mouse 重組小鼠 VSIG4 蛋白 (His & Fc 標簽)

CK18(Cytokeratin 18 0.5mgCK18(Cytokeratin 18) 細胞角蛋白18(多肽)

CFL2 Protein Human 重組人 CFL2 / cofilin 2 / ADF 蛋白

LGMN重組小鼠 Legumain/ LGMN 蛋白 Protein

VSIG4 Protein Mouse 重組小鼠 VSIG4 蛋白 (His & Fc 標簽)

PARP3重組人 PARP-3 / PARP3 蛋白 (His & GST 標簽) Protein

人軟骨細胞大鼠糖皮質激素誘導腫瘤壞死因子受體(GI)試劑盒  ，英文名 ： GI ELISA Kit

Niu Shousu (LEP) ELISA Kit 牛瘦素(LEP)試劑盒

RatDehydroepiandrosteronesulfate,DHEA-SELISAKit 大鼠脫輕表雄酮硫酸酯(DHEA-S)試劑盒 96T/48T 進口分裝

CLIAKitforHMGB-1ELISAKit大鼠高遷移率族蛋白B1

細胞PKCι激酶活性定量試劑盒(A/B/C)20次

ELISAKitE-Cad大鼠E鈣黏蛋白/上皮鈣黏蛋白