老哥俱乐部

实验报告：

一、分离与培养：

1
、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次
，将组织剪成1mm3左右大小
；

2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶）
，混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液

，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织被消化
；

4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清
，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ 
，5％CO2 培养箱中培养；

5
、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；二

、免疫荧光鉴定：

1
、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基
，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min
；

2

、PBS冲洗细胞2次
，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下
，用4% BSA封闭细胞30min；

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗
，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；

5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；

6
、用PBS冲洗3次
，每次10min，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

细胞简介
：

人角膜基质分离自眼角膜组织；角膜位于眼球前壁的一层透明膜，约占纤维膜的前1/6，从后面看角膜呈正圆形

，从前面看为横椭圆形。角膜厚度各部分不尽相同
，中央部薄。角膜有十分敏感的神经末梢，如有外物接触角膜，眼睑便会不由自主地合上以保护眼睛
。为了保持透明，角膜并没有血管，透过外界空气
、泪液及房水获取养份及氧气。角膜分为五层
，由前向后依次为：上皮细胞层
、前弹力层、基质层、后弹力层
、内皮细胞层。角膜基质层是角膜的主要组成部分，占据角膜厚度的90%，由角膜基质细胞、胶原纤维和细胞外基质构成。角膜基质层缺损的修复主要由角膜基质细胞的增殖及分泌细胞外基质完成
。角膜基质层具有结构规整，透明度高的特点，正常情况下角膜基质细胞分泌组成基质层的成分，维持角膜的透明度，此细胞对于角膜损伤的修复具有重要意义。角膜基质细胞，存在于角膜基质层中，在正常情况下
，处于静止状态。但当角膜损伤时

，不同上皮来源的因子及环境信号，将影响角膜基质细胞的应答反应，决定着角膜能否被修复。

方法简介：

公司实验室分离的人角膜基质采用胶原酶消化后组织贴块法制备而来
，细胞总量约为5×10?cells/瓶。

质量检测

公司实验室分离的人角膜基质经Vimentin免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养信息
：

培养基 含FBS
、生长添加剂、Penicillin
、Streptomycin等

换液频率 每2-3天换液一次

生长特性 贴壁

细胞形态 成纤维细胞样

传代特性 可传5代左右


；3代以内状态佳

消化液 0.25%

培养条件 气相：空气，95%；CO2
，5%

注意事项：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象

，若有上述现象发生请及时和老哥俱乐部联系
。

2. 仔细阅读细胞说明书
，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基
、血清比例、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致
，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担
。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面
，显微镜下观察细胞状态。因运输问题

，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片，是正常现象。观察好细胞状态后
，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h。

4. 贴壁细胞可以消化，悬浮细胞直接混匀收集细胞
，900 rpm-1000 rpm离心3 min

，弃上清。加5 mL PBS重悬细胞

，再900 rpm-1000 rpm离心3 min，
，用新鲜的*培养基重悬细胞，并接种到新的培养瓶或培养皿中，置于培养箱中进行培养。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养
。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片
，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流。由于运输的原因

，个别敏感细胞会出现不稳定的情况
，请及时和老哥俱乐部联系，告知细胞的具体情况，以便老哥俱乐部的技术人员跟踪回访直至问题解决
。

7. 该细胞仅供科研使用。

8. 备注
：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞
，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞。收到细胞后次传代建议1：2传代 。

9.注意： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿。不是1个T25瓶传2个10cm皿。

公司正在出售的产品
：

大鼠生长调节致癌基因α(GROα/CXCL1/MGSA)检测试剂盒 ，英文名： GROα/CXCL1/MGSA ELISA Kit

Neuroophic factor mouse glial cell line derived (GDNF) ELISA Kit 小鼠胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)检测试剂盒

MouseRetinol-bindingprotein4,RBP-4ELISAKit 小鼠结合蛋白4(RBP-4)检测试剂盒 96T/48T 进口分装

CLIAKitforHumanPeosidineELISAKit人戊糖素

同位素[γ32P]ATP激酶标记GST融合蛋白筛选试剂盒10次

ELISAKitx大鼠硫氧化还原蛋白

HA重组甲型流感 H13N8 (A/black-headed gull/Netherlands/1/00) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 蛋白 Protein

RNF148(Ring finger protein 148 0.5mgRNF148(Ring finger protein 148) 环指蛋白148抗原

TNFRSF10D重组人 TRAIL R4 / CD264 / TNFRSF10D 蛋白 Protein

CGB5 Protein Human 重组人 CGB5 蛋白 (Fc 标签)

IFNB1 Protein Human 重组人 Interferon beta / IFN-beta / IFNB 蛋白 (Fc 标签)

RNF148(Ring finger protein 148 0.5mgRNF148(Ring finger protein 148) 环指蛋白148抗原

CGB5 Protein Human 重组人 CGB5 蛋白 (Fc 标签)

HA重组甲型流感 H13N8 (A/black-headed gull/Netherlands/1/00) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 蛋白 Protein

IFNB1 Protein Human 重组人 Interferon beta / IFN-beta / IFNB 蛋白 (Fc 标签)

TNFRSF10D重组人 TRAIL R4 / CD264 / TNFRSF10D 蛋白 Protein

小鼠特异生长因子/相关因子(TSGF)ELISA 试剂盒 96T/48T

Human ai mitochondrial aibody (AMA) ELISA Kit 人抗线粒体抗体(AMA)检测试剂盒

Humanproteindisulfideisomerase,PDIELISAKit 人蛋白质二硫键异构酶(PDI)检测试剂盒 96T/48T 进口分装

CLIAKitforACA-IgA(Humanai-cardiolipinaibodyIgA)ELISAKit人抗心0脂抗体IgA

液相法去内毒素试剂盒20次

Mouseosteonectin,ONELISAKit小鼠骨粘连蛋白(ON)检测试剂盒规格：96T/48T

人角膜基质细胞小鼠糖原0酸化酶同工酶MM(GP-MM)ELISAKit   ELISA.   96T/48T

小鼠糖原0酸化酶同工酶BB(GP-BB)ELISAKit   ELISA.   96T/48T

小鼠甲状腺素抗体(TAb)ELISAKit   ELISA.   96T/48T

小鼠抗促甲状腺素受体抗体(Ab)ELISAKit   ELISA.   96T/48T