實驗報告 ：

一 、分離與培養 ：

1 、無菌條件下 ，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織 ，然後用PBS將此組織塊清洗2次 ，將組織剪成1mm3左右大小 ；

2 、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶） ，混懸10s ，置37℃條件下消化10min ，之後用滴管吹打製成單細胞懸液 ，自然沉澱並收集上清 ，用含10% FBS培養基終止消化後4℃放置 ；

3 、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液 ，混懸10s ，置37℃消化10 min後，按上述方法收集上清並終止消化後4℃放置 ，重複此步驟2-3次 ，直至組織被消化 ；

4 、用200目不鏽鋼篩網過濾細胞消化液 ，1200r/min 離心10min ，棄去上清 ，沉澱細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養基混懸 ，接種於25cm2培養瓶 ，放置於37℃ ，5％CO2 培養箱中培養 ；

5 、差速貼壁1h後 ，吸出培養基 ，按實驗需要接種於6孔板中繼續培養 ；二 、免疫熒光鑒定 ：

1 、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養基 ，用溫育的PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min ；

2 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在4℃條件下 ，用0.1％Triton X-100透膜15min ；

3 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在室溫條件下 ，用4% BSA封閉細胞30min ；

4 、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗 ，然後將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜 ；

5 、PBS衝洗細胞3次 ，每次10min ，按1 ：150的比例稀釋抗α-actin的二抗 ， 37℃條件下放置1h ；

6 、用PBS衝洗3次 ，每次10min ，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像並拍照 。

細胞簡介 ：

人宮頸癌組織源成纖維分離自患有宮頸癌病人的宮頸癌組織 ；宮頸癌也稱子宮頸癌 ，指發生在子宮陰道部及宮頸管的惡性腫瘤 ，是女性常見惡性腫瘤之一 ，發病率位於女性腫瘤的位 。宮頸癌可向鄰近組織和器官直接蔓延 ，向下至陰道穹窿及陰道壁 ，向上可侵犯子宮體 ，向兩側可侵犯盆腔組織 ，向前可侵犯膀胱 ，向後可侵犯直腸 。也可通過淋巴管轉移至宮頸旁 、髂內 、髂外 、腹股溝淋巴結 ，晚期甚至可轉移到鎖骨上及全身其他淋巴結 。血行轉移比較少見 ，常見的轉移部位是肺 、肝及骨 。腫瘤微環境即腫瘤細胞生存的外部環境 ，由不同種類的非腫瘤性的細胞與細胞外基質（Extracellular matrix ，ECM）構成 ，包括纖維細胞 ，免疫細胞 ，內皮細胞 ，間充質幹細胞等 ，腫瘤細胞通過調控這些間質細胞 ，創造出有利於自身侵襲轉移的條件 ，從而使得腫瘤得到進展 。越來越多的證據表明 ，腫瘤微環境的改變在腫瘤進展中扮演著重要的角色 。在腫瘤微環境中 ，研究多也是主要的間質細胞是腫瘤相關成纖維細胞（cancer-associated fibroblasts, CAFs） 。CAFs 主要由腫瘤周邊的正常成纖維細胞和成纖維細胞樣細胞演化而來 。宮頸癌組織源成纖維細胞多為突起的紡錘形或星形的扁平狀結構 ，其細胞核呈規則的卵圓形 ，核仁大而明顯 。剛分離的宮頸癌組織源成纖維細胞呈圓形 、折光性良好 ，懸浮於培養基中 。30min細胞貼壁 ，其中部分開始伸出偽足 ，表現為小的突起 ；6h後細胞基本貼壁 ，伸展成梭形 ，胞核清晰 ，分布較均勻 ，散在生長 ，不聚集成團 ；細胞生長迅速 ，5-7天即呈融合狀態 ，細胞排列緊密 ，有的交叉重疊生長 ，平坦 、胞體較大 ，細胞質透明 ，細胞核較大 ，呈橢圓形 ，顏色淡 。細胞融合 ，並彼此連接成網狀 ；細胞呈突起的紡錘形或星形的扁平分布 。

方法簡介 ：

公司實驗室分離的人宮頸癌成纖維采用混合膠原酶消化法結合差速貼壁法製備而來 ，細胞總量約為5×10?cells/瓶 。

質量檢測

公司實驗室分離的人宮頸癌成纖維經Vimentin免疫熒光鑒定 ，純度可達90%以上 ，且不含有HIV-1 、HBV 、HCV 、支原體 、細菌 、酵母和真菌等 。

培養信息 ：

培養基 含FBS 、生長添加劑 、Penicillin 、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細胞形態 成纖維細胞樣

傳代特性 可傳5代左右 ；3代以內狀態佳

消化液 0.25%

培養條件 氣相 ：空氣 ，95% ；CO2 ，5%

注意事項 ：

1. 收到細胞後首先觀察細胞瓶是否完好 ，培養液是否有漏液 、渾濁等現象 ，若有上述現象發生請及時和老哥俱樂部聯係 。

2. 仔細閱讀細胞說明書 ，了解細胞相關信息 ，如細胞形態 、所用培養基 、血清比例 、所需細胞因子等 ，確保細胞培養條件一致 ，若由於培養條件不一致而導致細胞出現問題 ，責任由客戶自行承擔 。

3. 用75%酒精擦拭細胞瓶表麵 ，顯微鏡下觀察細胞狀態 。因運輸問題 ，部分細胞由於溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片 ，是正常現象 。觀察好細胞狀態後 ，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置於37℃培養箱放置4-6h 。

4. 貼壁細胞可以消化 ，懸浮細胞直接混勻收集細胞 ，900 rpm-1000 rpm離心3 min ，棄上清 。加5 mL PBS重懸細胞 ，再900 rpm-1000 rpm離心3 min ， ，用新鮮的*培養基重懸細胞 ，並接種到新的培養瓶或培養皿中 ，置於培養箱中進行培養 。

5. 請客戶用相同條件的培養基用於細胞培養 。

6. 建議客戶收到細胞後前3天各拍幾張細胞照片 ，記錄細胞狀態 ，便於和我司技術部溝通交流 。由於運輸的原因 ，個別敏感細胞會出現不穩定的情況 ，請及時和老哥俱樂部聯係 ，告知細胞的具體情況 ，以便老哥俱樂部的技術人員跟蹤回訪直至問題解決 。

7. 該細胞僅供科研使用 。

8. 備注 ：運輸用的培養基(灌液培養基)不能再用來培養細胞 ，請換用按照說明書細胞培養條件新配製的*培養基來培養細胞 。收到細胞後次傳代建議1 ：2傳代  。

9.注意 ： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿 。不是1個T25瓶傳2個10cm皿 。

公司正在出售的產品 ：

兔血管生成素2(ANG-2)ELISA 試劑盒

Oxidized low density lipoprotein aibody against rat (OLAb) ELISA Kit 大鼠氧化低密度脂蛋白抗體(OLAb)檢測試劑盒

HumanLeishimariaaibodyELISAKit 人利什曼原蟲抗體(LeishimariaAb)檢測試劑盒 96T/48T 進口分裝

HumanFreeTestoterone,F-TESTO檢測試劑盒人遊離睾同(F-TESTO)檢測試劑盒規格 ：96T/48T

組織半胱蛋白酶-3(CASPASE-3)活性熒光定量檢測試劑盒20次

HumanNeural-Cadherin,N-CadELISAKit人N鈣黏蛋白/神經鈣黏蛋白(N-Cad)檢測試劑盒規格 ：96T/48T

CXADR重組小鼠 CXADR / CAR 蛋白 Protein

骨成型蛋白2(BMP2)重組蛋白 Recombinant Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP2)

PDHA1重組人 PDHA1 / C54G1 蛋白 (aa 30-390, His & GST 標簽) Protein

CEACAM3 Protein Human 重組人 CEACAM3 / CD66d 蛋白

TGFB2 Protein Canine 重組狗 TGFB2 / TGF-beta 2 蛋白

白介素16(IL16)重組蛋白 Recombinant Interleukin 16 (IL16)

CEACAM3 Protein Human 重組人 CEACAM3 / CD66d 蛋白

IL5重組小鼠 IL5 蛋白 Protein

TSPAN7 Protein Cynomolgus 重組食蟹猴 TALLA-1 / TSPAN7 蛋白

PFDN4重組人 PFDN4 / PFD4 蛋白 Protein

小鼠A(VA)ELISA 試劑盒 96T/48T

Rat osteonectin (ON) ELISA Kit 大鼠骨粘連蛋白(ON)檢測試劑盒

HumanCCAAT/enhancerbindingproteinalpha,C/EBPαELISAKit 人CCAAT增強子結合蛋白α(C/EBPα)檢測試劑盒 96T/48T 進口分裝

ChickenLeinizingHormone,LH檢測試劑盒雞促黃體激素(LH)檢測試劑盒規格 ：96T/48T

載玻片細胞NFKAPPABP50蛋白表達熒光顯微鏡檢測試劑盒10/20次

MouseFreei-iodothyronineIndes,Free-T3ELISAKit小鼠遊離三甲狀腺原(Free-T3)檢測試劑盒規格 ：96T/48T

人宮頸癌成纖維細胞小鼠胃動素(MTL)檢測試劑盒   96T/48T   試劑盒   組裝/原裝

小鼠(Pepsin)檢測試劑盒   96T/48T   試劑盒   組裝/原裝

小鼠胃腸癌標誌物CA199檢測試劑盒   96T/48T   試劑盒   組裝/原裝

小鼠K1(VK1)檢測試劑盒   96T/48T   試劑盒   組裝/原裝