實驗報告 ：

一 、分離與培養 ：

1 、無菌條件下 ，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織 ，然後用PBS將此組織塊清洗2次 ，將組織剪成1mm3左右大小 ；

2 、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶） ，混懸10s ，置37℃條件下消化10min ，之後用滴管吹打製成單細胞懸液 ，自然沉澱並收集上清 ，用含10% FBS培養基終止消化後4℃放置 ；

3 、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液 ，混懸10s ，置37℃消化10 min後 ，按上述方法收集上清並終止消化後4℃放置 ，重複此步驟2-3次 ，直至組織被消化 ；

4 、用200目不鏽鋼篩網過濾細胞消化液 ，1200r/min 離心10min ，棄去上清 ，沉澱細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養基混懸 ，接種於25cm2培養瓶 ，放置於37℃  ，5％CO2 培養箱中培養 ；

5 、差速貼壁1h後 ，吸出培養基 ，按實驗需要接種於6孔板中繼續培養 ；二 、免疫熒光鑒定 ：

1 、待心房肌細胞生長至80%融合時 ，棄去培養基 ，用溫育的PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min ；

2 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在4℃條件下 ，用0.1％Triton X-100透膜15min ；

3 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在室溫條件下 ，用4% BSA封閉細胞30min ；

4 、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗 ，然後將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜 ；

5、PBS衝洗細胞3次 ，每次10min ，按1 ：150的比例稀釋抗α-actin的二抗 ， 37℃條件下放置1h ；

6 、用PBS衝洗3次 ，每次10min ，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像並拍照 。

細胞簡介 ：

人肺大靜脈內皮分離自肺大靜脈組織 ；肺大靜脈在用肺呼吸的脊椎動物中 ，把動脈血由肺送回心髒的靜脈 ，是一個靜脈裏流動脈血的血管 。左右1對 ，共4條 ，兩條連接右肺 ，兩條連接左肺 。肺靜脈異位引流是指肺靜脈未能直接與左心房連接 ，而與右心房或體靜脈係統連接的先天性心血管異位 。肺靜脈淤血性肺動脈高壓 ，是由於肺靜脈內血液淤滯而引起的肺動脈高壓 。正常情況下 ，肺循環具有血壓低 、阻力小和順應性大的特點 ，肺動脈壓力高低取決於單位時間內肺動脈血流量和肺血管的阻力 ，要維持肺循環的低壓 、低阻的狀態 ，必須保證整個肺循環係統的暢通無阻 ，血液順利地由肺動脈經毛細血管進入肺靜脈 ，再入左心室 ，經過左心室收縮進入體循環 ，才能避免肺動脈內壓力升高 。細胞呈多邊形鵝卵石狀排列 ；該細胞在維持血管內外的動態平衡 、合成和分泌細胞因子和介質 、維持凝血和纖溶的動態平衡中起重要作用 。

方法簡介 ：

公司實驗室分離的人肺大靜脈內皮采用-膠原酶聯合消化法結合差速貼壁法 、並通過內皮細胞專用培養基培養篩選製備而來 ，細胞總量約為5×10?cells/瓶 。

質量檢測

公司實驗室分離的人肺大靜脈內皮經CD31免疫熒光鑒定 ，純度可達90%以上 ，且不含有HIV-1 、HBV 、HCV 、支原體 、細菌 、酵母和真菌等 。

培養信息 ：

包被條件 PLL（0.1mg/ml） ，明膠（0.1%）

培養基 含FBS 、生長添加劑 、Penicillin 、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細胞形態 內皮細胞樣

傳代特性 可傳2-3代

消化液 0.25%

培養條件 氣相 ：空氣 ，95% ；CO2 ，5%

注意事項 ：

1. 收到細胞後首先觀察細胞瓶是否完好 ，培養液是否有漏液 、渾濁等現象 ，若有上述現象發生請及時和老哥俱樂部聯係 。

2. 仔細閱讀細胞說明書 ，了解細胞相關信息 ，如細胞形態 、所用培養基 、血清比例 、所需細胞因子等 ，確保細胞培養條件一致 ，若由於培養條件不一致而導致細胞出現問題 ，責任由客戶自行承擔 。

3. 用75%酒精擦拭細胞瓶表麵 ，顯微鏡下觀察細胞狀態 。因運輸問題 ，部分細胞由於溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片 ，是正常現象 。觀察好細胞狀態後 ，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置於37℃培養箱放置4-6h 。

4. 貼壁細胞可以消化 ，懸浮細胞直接混勻收集細胞 ，900 rpm-1000 rpm離心3 min ，棄上清 。加5 mL PBS重懸細胞 ，再900 rpm-1000 rpm離心3 min ， ，用新鮮的*培養基重懸細胞 ，並接種到新的培養瓶或培養皿中 ，置於培養箱中進行培養 。

5. 請客戶用相同條件的培養基用於細胞培養 。

6. 建議客戶收到細胞後前3天各拍幾張細胞照片 ，記錄細胞狀態 ，便於和我司技術部溝通交流 。由於運輸的原因 ，個別敏感細胞會出現不穩定的情況 ，請及時和老哥俱樂部聯係 ，告知細胞的具體情況 ，以便老哥俱樂部的技術人員跟蹤回訪直至問題解決 。

7. 該細胞僅供科研使用 。

8. 備注 ：運輸用的培養基(灌液培養基)不能再用來培養細胞 ，請換用按照說明書細胞培養條件新配製的*培養基來培養細胞 。收到細胞後次傳代建議1 ：2傳代  。

9.注意 ： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿 。不是1個T25瓶傳2個10cm皿 。

公司正在出售的產品 ：

大鼠骨形成蛋白6(BMP6)檢測試劑盒  ，英文名 ： BMP6 ELISA Kit

People aminoterminal propeptide of type III procollagen (P III ) ELISA Kit 人Ⅲ型前膠原氨基端肽(PⅢ)檢測試劑盒

RatAngiotensinconveingenzyme,ACEELISAKit 大鼠血管緊張素轉化酶(ACE)檢測試劑盒 96T/48T 進口分裝

CLIAKitforEMAIgA(Humanai-EndomysialAibodyIgA)ELISAKit人抗肌內膜抗體IgA

細胞內核酸氧化8-羥基鳥苷(8-OHG流式細胞分析試劑盒10次

RatIerleukin8,IL-8ELISAKit大鼠白介素8(IL-8/CXCL8)檢測試劑盒規格 ：96T/48T

TNFRSF19重組小鼠 TNFRSF19 / TROY 蛋白 (His & Fc 標簽) Protein

CD19(B-lymphocyte antigen CD19 0.5mgCD19(B-lymphocyte antigen CD19) CD19

TXNDC17重組人 TXNDC17 / TRP14 / TXNL5 蛋白 Protein

CDK7 & CCNH & MNAT1 Protein Human 重組人 CDK7 & CCNH & MNAT1 Heterotrimer 蛋白

SELP Protein Rat 重組大鼠 SELP / selectin P / P-selectin 蛋白

CD19(B-lymphocyte antigen CD19 0.5mgCD19(B-lymphocyte antigen CD19) CD19

CDK7 & CCNH & MNAT1 Protein Human 重組人 CDK7 & CCNH & MNAT1 Heterotrimer 蛋白

TNFRSF19重組小鼠 TNFRSF19 / TROY 蛋白 (His & Fc 標簽) Protein

SELP Protein Rat 重組大鼠 SELP / selectin P / P-selectin 蛋白

TXNDC17重組人 TXNDC17 / TRP14 / TXNL5 蛋白 Protein

小鼠(VE)ELISA 試劑盒 96T/48T

Rat CrossLaps ELISA Kit (Cr) 大鼠骨膠原交聯(Cr)檢測試劑盒

Humansorbitoldehydrogenase,SDHELISAKit 人脫輕酶(SDH)檢測試劑盒 96T/48T 進口分裝

ChickenIerleukin6,IL-6檢測試劑盒雞白介素6(IL-6)檢測試劑盒規格 ：96T/48T

載玻片細胞IL蛋白表達熒光顯微鏡檢測試劑盒10/20次

Mouseglucocoicoidreceptor,GRELISAKit小鼠糖皮質類固醇受體(GR)檢測試劑盒規格 ：96T/48T

人肺大靜脈內皮細胞小鼠細胞色素P450(mouse Cytochrome P450)   作用 ：   ELISA   規格 ：      進口分裝

小鼠C反應蛋白(mouse CRP)   作用 ：   ELISA   規格 ：      進口分裝

小鼠CXC趨化因子受體3(mouse CXCR3)   作用 ：   ELISA   規格 ：      進口分裝

小鼠CXC趨化因子配體16(mouse CXCL16)   作用 ：   ELISA   規格 ：      進口分裝