老哥俱乐部

实验报告：

一、分离与培养：

1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次
，将组织剪成1mm3左右大小；

2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶）
，混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置
；

3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液
，混悬10s，置37℃消化10 min后
，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织被消化；

4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清
，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养
；

5、差速贴壁1h后，吸出培养基
，按实验需要接种于6孔板中继续培养
；二、免疫荧光鉴定
：

1
、待心房肌细胞生长至80%融合时
，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次
，每次10min
，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

2、PBS冲洗细胞2次，每次10min
，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS冲洗细胞2次，每次10min
，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜
；

5
、PBS冲洗细胞3次，每次10min
，按1

：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；

6、用PBS冲洗3次，每次10min
，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照
。

细胞简介
：

大鼠外周血DC分离自外周血，由外周血单核细胞诱导而成的；外周血是除骨髓之外的血液，临床上常用一些方法把骨髓中的造血干细胞释放到血液中，再在从血液中提取分离得到造血干细胞
，老哥俱乐部把这样得到的干细胞称为外周血干细胞，在二十一世纪初人类开始的生命方舟计划中提出外周血这一新概念。树突状细胞分为成熟树突状细胞和未成熟树突状细胞，典型的未成熟树突状细胞呈半贴壁生长，在GM-CSF

、IL4的作用下形成葡萄串样集落
，细胞大而形态不规则，表面皱褶多，亦可见少量短刺状突，胞内细胞器丰富并可见吞噬泡，具有较强的迁移能力
，伴随有部分未诱导成的单核细胞，贴壁形态多样
。而成熟的树突状细胞由未成熟DC进一步经TNFα、LPS等诱导而成，多数呈悬浮生长
， 细胞呈圆形，细胞体积进一步增大，表面大量粗细不等的树枝样突起(高倍镜或者电镜下可观察到 )
，伴随少量贴壁未成熟细胞或者单核细胞。未成熟DC细胞长时间培养也可能导致自发分化成熟
。DC细胞尚无特异性细胞表面分子标志
，主要通过形态学、组合性细胞表面标志
、在混合淋巴细胞反应中能激活初始T细胞等特征进行鉴定。其中成熟树突状细胞表面高表达主要组织相容性复合物(MHC)以及CD80、CD86等共刺激分子
，进而激活T淋巴细胞，诱导免疫应答，处于启动、调控
、并维持免疫应答的中心环节；未成熟树突状细胞具有很强的抗原摄取加工能力，但由于缺乏多种共刺激分子不能使初始T细胞活化、增殖产生免疫应答，不能激活T细胞的信号，可导致T细胞无能
，从而诱导免疫低反应或抗原免疫特异性耐受。未成熟树突状细胞表面CD80
、CD86、MHC-Ⅱ类分子等共刺激分子表达较低
，一般在30%以下。

方法简介
：

实验室分离的大鼠外周血未成熟DC采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞、培养过程添加细胞因子诱导而来，细胞总量约为5×10⁵cells/瓶。

质量检测

实验室分离的大鼠外周血树突状(未成熟DC细胞)经CD86免疫荧光鉴定
、细 胞 形态等综合鉴定

，纯度可达80%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体
、细菌、酵母和真菌等。

培养信息：

培养基：含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等

换液频率
：每2-3天换液一次

生长特性
：半贴壁半悬浮

细胞形态：圆形、梭形
、多角形
，形态多样

传代特性
：属于高度分化细胞；属于不增殖细胞群

消化液
：0.25%

培养条件：气相
：空气
，95%；CO2，5%

大鼠外周血树突状(未成熟DC细胞)体外培养周期有限
；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养
，以此保证该细胞的佳培养状态
。

注意事项：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液
、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和老哥俱乐部联系
。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致
，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担
。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态。因运输问题，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片
，是正常现象
。观察好细胞状态后
，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h

。

4. 贴壁细胞可以消化，悬浮细胞直接混匀收集细胞
，900 rpm-1000 rpm离心3 min，弃上清
。加5 mL PBS重悬细胞，再900 rpm-1000 rpm离心3 min
，
，用新鲜的*培养基重悬细胞，并接种到新的培养瓶或培养皿中，置于培养箱中进行培养。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态
，便于和我司技术部沟通交流。由于运输的原因
，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和老哥俱乐部联系，告知细胞的具体情况，以便老哥俱乐部的技术人员跟踪回访直至问题解决。

7. 该细胞仅供科研使用
。

8. 备注：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞
。收到细胞后次传代建议1：2传代

。

9.注意： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿
。不是1个T25瓶传2个10cm皿。

公司正在出售的产品：

大鼠S转移酶θ1(GSTT1)检测试剂盒 ，英文名： GSTT1 ELISA Kit

Porcine B cell lymphoma factor 2 (Bcl-2) ELISA Kit 猪B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)检测试剂盒

菌(VC)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法) 48T

CLIAKitforMIP-3Alpha/CCL20(HumanMacrophageInflammatoryProtein-3Alpha)ELISAkit人巨噬细胞性蛋白3α

体液精(arginine)含量化学比色法定量检测试剂盒20次

ELISAKitIL-18犬白介素18

IgG1重组人 IgG1-Fc 蛋白 (103 Cys/Ser) Protein

神经元特异性烯醇化酶(NSE)重组蛋白 Recombinant Enolase, Neuron Specific (NSE)

RNF43重组人 RNF43 蛋白 Protein

CD4 Protein Human 重组人 CD4 / LEU3 蛋白

HA Protein H8N4 重组甲型流感 H8N4 (A/pintail duck/Alberta/114/1979) 血凝素HA1 (Hemagglutinin) 蛋白

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HA Protein H8N4 重组甲型流感 H8N4 (A/pintail duck/Alberta/114/1979) 血凝素HA1 (Hemagglutinin) 蛋白

RNF43重组人 RNF43 蛋白 Protein

小鼠血管生成素受体Tie1(ANG-R-Tie1)ELISA 试剂盒 96T/48T

Human leukocyte aigen C (HLA-C) ELISA Kit 人类白细胞抗原C(HLA-C)检测试剂盒

HumanL-phenylalanine,LPAELISAKit 人苯(LPA)检测试剂盒 96T/48T 进口分装

rabbitImmunoglobulinM,IgM检测试剂盒兔子免疫球蛋白M(IgM)检测试剂盒规格：96T/48T

油菜样品处理试剂盒20次

Mouseierferon-inducibleprotein10,IP-10ELISAKit小鼠干扰素诱导蛋白10(IP-10/CXCL10)检测试剂盒规格：96T/48T

大鼠外周血树突状细胞(未成熟DC细胞)小鼠胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP-2)检测试剂盒   96T/48T   试剂盒   组装/原装

小鼠胰岛素样生长因子结合蛋白1(IGFBP-1)检测试剂盒   96T/48T   试剂盒   组装/原装

小鼠胰岛素样生长因子2(IGF-2)检测试剂盒   96T/48T   试剂盒   组装/原装

小鼠胰岛素样生长因子1(IGF-1)检测试剂盒   96T/48T   试剂盒   组装/原装