老哥俱乐部

实验报告：

一
、分离与培养：

1
、无菌条件下
，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次
，将组织剪成1mm3左右大小；

2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶）
，混悬10s，置37℃条件下消化10min
，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清
，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置
；

3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s

，置37℃消化10 min后

，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织被消化；

4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液

，1200r/min 离心10min
，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ 
，5％CO2 培养箱中培养

；

5
、差速贴壁1h后
，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；二
、免疫荧光鉴定
：

1
、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次
，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

2、PBS冲洗细胞2次
，每次10min
，然后在4℃条件下
，用0.1％Triton X-100透膜15min
；

3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下
，用4% BSA封闭细胞30min
；

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜
；

5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h
；

6、用PBS冲洗3次，每次10min
，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照

。

细胞简介：

大鼠颞下颌关节软骨分离自颞下颌关节软骨组织，颞下颌关节又称颞颌关节"或下颌关节"。由下颌头与颞骨下颌窝和关节结节组成，左右合成一联合关节，主理张口闭口和咀嚼运动
。关节囊松弛，侧方为内
、外侧韧带所加强。囊内的关节盘呈卵圆形，由纤维软骨组成
，区分为前
、中、后三部分。上面呈鞍状，前凹后凸，与关节结节和下颌窝的凸凹轮廓相对应；下面凹正对下颌头，周缘与关节囊相接，前缘与穿过关节囊的翼外肌腱相连
。关节盘将关节腔分成上、下两半

。关节外更有蝶下颌韧带(蝶棘至下颌小舌)和茎突下颌韧带(茎突至下颌角)予以加固。关节软骨属于透明软骨，表面光滑
、呈淡蓝色、有光泽，它是由一种特殊的叫做致密结缔组织的胶原纤维构成的基本框架
，这种框架呈半环形
，类似拱形球门
，其底端紧紧附着在下面的骨质上，上端朝向关节面，这种结构使关节软骨紧紧与骨结合起来而不会掉下来，同时当受到压力时候，还可以有少许的变形，起到缓冲压力的作用。在这些纤维之间，散在分布着软骨细胞，软骨细胞由浅层向深层逐渐由扁平样至椭圆或圆形的细胞组成，这些软骨细胞维持关节软骨的正常代谢。关节软骨没有神经支配，也没有血管
，其营养成分必须从关节液中取得
，而其代谢废物也必须排至关节液中，关节软骨的这种营养代谢必须通过关节运动，使关节软骨不断的受到压力刺激才行
，所以关节运动对于维持关节软骨的正常结构起重要的作用

。关节软骨细胞位于关节软骨陷窝内

。幼稚的关节软骨细胞位于关节软骨组织的表层，单个分布、体积较小、呈椭圆形，长轴与关节软骨表面平行
，越向深层的关节软骨细胞体积之间增大呈圆形，细胞核圆形或卵圆形、染色浅，细胞质弱嗜碱性，常见数量不一的脂滴

。成熟的关节软骨细胞多2-8个成群分布于关节软骨陷窝内，这些关节软骨细胞由同一个母细胞分裂增殖而成，称为同源细胞群。电镜下，关节软骨细胞有突起和皱褶，细胞质内有大量的粗面内质网和发达的高尔基复合体及少量的线粒体

。在组织切片中，关节软骨细胞收缩为不规则形，在软骨囊和细胞之间出现较大的腔隙。体外培养的关节软骨细胞对于研究其生理功能、药物作用以及各种致病因素作用下的病理生理改变具重要意义。

方法简介
：

公司实验室分离的大鼠颞下颌关节软骨采用胶原酶联合消化制备而来

，细胞总量约为5×10?cells/瓶。

质量检测

公司实验室分离的大鼠颞下颌关节软骨经Ⅱ型胶原蛋白免疫荧光鉴定
，纯度可达90%以上

，且不含有HIV-1、HBV
、HCV、支原体、细菌
、酵母和真菌等。

培养信息
：

培养基 含FBS、生长添加剂
、Penicillin、Streptomycin等

换液频率 每3-4天换液一次

生长特性 贴壁

细胞形态 梭形、多角形

传代特性 可传5代左右；3代以内状态

消化液 0.25%

培养条件 气相：空气，95%；CO2
，5%

注意事项：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象
，若有上述现象发生请及时和老哥俱乐部联系
。

2. 仔细阅读细胞说明书
，了解细胞相关信息，如细胞形态
、所用培养基、血清比例
、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态
。因运输问题，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片，是正常现象。观察好细胞状态后
，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h
。

4. 贴壁细胞可以消化，悬浮细胞直接混匀收集细胞，900 rpm-1000 rpm离心3 min

，弃上清。加5 mL PBS重悬细胞
，再900 rpm-1000 rpm离心3 min
，，用新鲜的*培养基重悬细胞，并接种到新的培养瓶或培养皿中
，置于培养箱中进行培养
。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养
。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片

，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流
。由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和老哥俱乐部联系，告知细胞的具体情况，以便老哥俱乐部的技术人员跟踪回访直至问题解决。

7. 该细胞仅供科研使用。

8. 备注：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞。收到细胞后次传代建议1
：2传代 。

9.注意： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿


。不是1个T25瓶传2个10cm皿
。

公司正在出售的产品：

大鼠络丝蛋白(RL)检测试剂盒 ，英文名： RL ELISA Kit

Mouse insulin like growth factor binding protein 2 (IGFBP-2) ELISA Kit 小鼠胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP-2)检测试剂盒

RatsolubleClusterofdiffereiation86,sCD86ELISAKit 大鼠可溶性白细胞分化抗原86(B7-2/sCD86)检测试剂盒 96T/48T 进口分装

CLIAKitforGDNF(Humanglialcellline-derivedneuroophicfactor)ELISAKIT人胶质细胞系来源的神经营养因子

细胞肝脂酶活性比色法定量检测试剂盒20次

Ratsexhormone-bindingglobulin,SHBGELISAKit大鼠性激素结合球蛋白(SHBG)检测试剂盒规格
：96T/48T

CSF1R重组人 CSF1R / MCSF Receptor / CD115 蛋白 (His & Fc 标签) Protein

通用转录因子ⅡH肽1(GTF2H1)重组蛋白 Recombinant General Transcription Factor IIH, Polypeptide 1 (GTF2H1)

NAPA重组人 NAPA / alpha-SNAP 蛋白 Protein

ESAM Protein Human 重组人 ESAM / Endothelial Cell Adhesion Molecule 蛋白

HA Protein H5N1 重组甲型流感 H5N1 (A/duck/Hunan/795/2002) 血凝素HA1 (Hemagglutinin) 蛋白

通用转录因子ⅡH肽1(GTF2H1)重组蛋白 Recombinant General Transcription Factor IIH, Polypeptide 1 (GTF2H1)

ESAM Protein Human 重组人 ESAM / Endothelial Cell Adhesion Molecule 蛋白

CSF1R重组人 CSF1R / MCSF Receptor / CD115 蛋白 (His & Fc 标签) Protein

HA Protein H5N1 重组甲型流感 H5N1 (A/duck/Hunan/795/2002) 血凝素HA1 (Hemagglutinin) 蛋白

NAPA重组人 NAPA / alpha-SNAP 蛋白 Protein

小鼠坏死因子可溶性受体Ⅰ(TNFsR-Ⅰ)ELISA 试剂盒 96T/48T

Human signal recognization paicle aibody (SRP) ELISA Kit 人抗信号识别颗粒抗体(SRP)检测试剂盒

Humansecretorycompone,SCELISAKit 人分泌成分(SC)检测试剂盒 96T/48T 进口分装

CLIAKitforACAELISAKit大鼠抗中性粒/中心体抗体

一抗涂板(COATING)缓冲液100毫升

Mousenuclearfactor-κBp65,NF-κBp65ELISAKit小鼠核因子κB亚基p65亲和肽(NF-κBp65)检测试剂盒规格

：96T/48T

大鼠颞下颌关节软骨细胞小鼠癌标志物检测试剂盒   小鼠癌标志物试剂盒   规格型号：96T/48T   小鼠癌标志物试剂盒，规格型号：96T/48T
，来源：检测试剂盒（进口分装），产品别名
：小鼠癌标志物试剂盒、小鼠癌标志物检测试剂盒   保存条件：2-8℃   保质期

：6个月
。

小鼠淋巴细胞趋化因子检测试剂盒   小鼠淋巴细胞趋化因子试剂盒   规格型号
：96T/48T   小鼠淋巴细胞趋化因子试剂盒
，规格型号
：96T/48T，来源：检测试剂盒（进口分装），产品别名
：小鼠淋巴细胞趋化因子试剂盒
、小鼠淋巴细胞趋化因子检测试剂盒   保存条件：2-8℃   保质期：6个月。

小鼠淋巴细胞功能相关抗原检测试剂盒   小鼠淋巴细胞功能相关抗原试剂盒   规格型号：96T/48T   小鼠淋巴细胞功能相关抗原试剂盒，规格型号：96T/48T
，来源
：检测试剂盒（进口分装），产品别名：小鼠淋巴细胞功能相关抗原试剂盒
、小鼠淋巴细胞功能相关抗原检测试剂盒   保存条件：2-8℃   保质期
：6个月
。

小鼠可溶性血小板内皮细胞粘附分子检测试剂盒   小鼠可溶性血小板内皮细胞粘附分子试剂盒   规格型号
：96T/48T   小鼠可溶性血小板内皮细胞粘附分子试剂盒
，规格型号：96T/48T
，来源：检测试剂盒（进口分装）
，产品别名：小鼠可溶性血小板内皮细胞粘附分子试剂盒

、小鼠可溶性血小板内皮细胞粘附分子检测试剂盒   保存条件：2-8℃   保质期
：6个月。