老哥俱乐部

实验报告：

一
、分离与培养：

1
、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次

，将组织剪成1mm3左右大小；

2
、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液
，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置
；

3
、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织被消化
；

4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清
，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬
，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃
，5％CO2 培养箱中培养
；

5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；二
、免疫荧光鉴定：

1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次


，每次10min
，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min
；

3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下
，用4% BSA封闭细胞30min；

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗
，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜
；

5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；

6、用PBS冲洗3次
，每次10min，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

细胞简介：

大鼠骨髓来源内皮祖分离自骨髓
；骨髓是机体的造血组织，位于身体的许多骨骼内
。成年动物的骨髓分两种

：红骨髓和黄骨髓。红骨髓能制造红细胞、血小板和各种白细胞。血小板有止血作用，白细胞能杀灭与抑制各种病原体

，包括细菌

、病毒等；某些淋巴细胞能制造抗体。因此

，骨髓不但是造血器官，它还是重要的免疫器官

。骨髓是存在于长骨（如肱骨、股骨）的骨髓腔和扁平骨（如髂骨）的稀松骨质间的网眼中，是一种海绵状的组织
，能产生血细胞的骨髓略呈红色，称为红骨髓。出生时
，红骨髓充满全身骨髓腔，随着年龄增大
，脂肪细胞增多，相当部分红骨髓被黄骨髓取代
，后几乎只有扁平骨骨髓腔中有红骨髓
。内皮祖细胞是血管内皮细胞的前体细胞，亦称为成血管细胞（Angioblast），是一群具有游走特性
，能进一步增殖分化的幼稚内皮细胞
，缺乏成熟内皮细胞的特征性表型
，不能形成管腔样结构，其功能主要为参与了出生后缺血组织的血管发生和血管损伤后的修复

。研究显示，内皮祖细胞在心脑血管疾病
、外周血管疾病、肿瘤血管形成及创伤愈合等方面均发挥重要作用
，并为缺血性疾病的研究治疗提供了新思路，EPCs生物学特性和治疗作用的研究成为这一领域新的热点
。

方法简介：

公司实验室分离的大鼠骨髓来源内皮祖采用冲洗骨髓、密度梯度离心、差速贴壁法结合内皮细胞专用培养基培养筛选制备而来
，细胞总量约为5×10?cells/瓶
。

质量检测

公司实验室分离的大鼠骨髓来源内皮祖经CD34免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上
，且不含有HIV-1
、HBV、HCV、支原体
、细菌、酵母和真菌等。

培养信息：

包被条件 PLL（0.1mg/ml），明胶（0.1%）

培养基 含FBS、生长添加剂
、Penicillin
、Streptomycin等

换液频率 每2-3天换液一次

生长特性 贴壁

细胞形态 内皮细胞样

传代特性 可传1-2代；不建议多次传代

消化液 0.25%

培养条件 气相

：空气
，95%；CO2，5%

注意事项：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象
，若有上述现象发生请及时和老哥俱乐部联系。

2. 仔细阅读细胞说明书
，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等
，确保细胞培养条件一致，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担
。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态。因运输问题，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片，是正常现象。观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h
。

4. 贴壁细胞可以消化

，悬浮细胞直接混匀收集细胞，900 rpm-1000 rpm离心3 min，弃上清。加5 mL PBS重悬细胞，再900 rpm-1000 rpm离心3 min，，用新鲜的*培养基重悬细胞，并接种到新的培养瓶或培养皿中，置于培养箱中进行培养
。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片
，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流
。由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和老哥俱乐部联系，告知细胞的具体情况，以便老哥俱乐部的技术人员跟踪回访直至问题解决。

7. 该细胞仅供科研使用。

8. 备注
：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞。收到细胞后次传代建议1：2传代 。

9.注意： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿
。不是1个T25瓶传2个10cm皿。

公司正在出售的产品：

植物血凝素   5mg

Lectin,fromArachisHypogaea(pean)

植物血凝素   5mg

Lectin,fromiticumvulgaris

猪Ⅲ型前胶原肽(PⅢNP)ELISA 试剂盒

Human ai proteinase 3 aibody IgG (PR3 Ab-IgG) ELISA Kit 人抗蛋白酶3抗体IgG(PR3 Ab-IgG)试剂盒

Porcinehepatocytegrowthfactor,HGFELISAKit 猪肝细胞生长因子(HGF)试剂盒 进口分装

CLIAKitfora-Glu(MouseAlpha-Glucosidase)ELISAKit小鼠α葡萄糖苷酶

血液乳酸脱氢酶(LDH)总活性酶动力比色法定量试剂盒20次

Mouseansforminggrowthfactorα,TGF-αELISAKit小鼠转化生长因子α(TGF-α)试剂盒

BST1重组大鼠 CD157 / BST1 蛋白 (His 标签) Protein

Galanin 神经节肽 0.5mgGalanin 神经节肽

CXCL1重组人 CXCL1 / MGSA / NAP-3 蛋白 (His & SUMO 标签) Protein

AGER Protein Human 重组人 AGER / RAGE 蛋白

SLAMF8 Protein Mouse 重组小鼠 SLAMF8 / BLAME 蛋白 (His 标签)

Galanin 神经节肽 0.5mgGalanin 神经节肽

AGER Protein Human 重组人 AGER / RAGE 蛋白

BST1重组大鼠 CD157 / BST1 蛋白 (His 标签) Protein

SLAMF8 Protein Mouse 重组小鼠 SLAMF8 / BLAME 蛋白 (His 标签)

CXCL1重组人 CXCL1 / MGSA / NAP-3 蛋白 (His & SUMO 标签) Protein

大鼠骨髓来源内皮祖细胞小鼠抗(AT)ELISA 试剂盒

Rat ai monocyte aibody (AMA) ELISA Kit 大鼠抗单核细胞抗体(AMA)试剂盒

HumanfibrinopeptideB,FPBELISAKit 人血纤肽/纤维蛋白肽B(FPB)试剂盒 进口分装

HumanAmebiasis试剂盒人阿米巴(Amebiasis)试剂盒

植物单酚氧化酶(monophenolase)活性比色法定量试剂盒20次

MonkeyIerleukin2,IL-2ELISAKit猴白介素2(IL-2)试剂盒