實驗報告 ：
一 、分離與培養
1 、無菌條件下 ，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織 ，然後用PBS將此組織塊清洗2次 ，將成1mm3左右大小 ；
2 、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶） ，混懸10s ，置37℃條件下消化10min ，之後用滴管吹打製成單細胞懸液 ，自然沉澱並收集上清 ，用含10% FBS培養基終止消化後4℃放置 ；
3 、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液 ，混懸10s ，置37℃消化10 min後 ，按上述方法收集上清並終止消化後4℃放置 ，重複此步驟2-3次 ，直至組織*被消化 ；
 4 、用200目不鏽鋼篩網過濾細胞消化液 ，1200r/min 離心10min ，棄去上清，沉澱細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養基混懸，接種於25cm2培養瓶 ，放置於37℃  ，5％CO2 培養箱中培養 ；
 5 、差速貼壁1h後 ，吸出培養基 ，按實驗需要接種於6孔板中繼續培養 ；
二 、免疫熒光鑒定 ：
1 、待心房肌細胞生長至80%融合時 ，棄去培養基 ，用溫育的PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min ；
 2 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在4℃條件下 ，用0.1％Triton X-100透膜15min ；
3 、PBS衝洗細胞2次 ，每次10min ，然後在室溫條件下 ，用4% BSA封閉細胞30min ；
 4 、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗 ，然後將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜 ；
5 、PBS衝洗細胞3次 ，每次10min ，按1 ：150的比例稀釋抗α-actin的二抗 ， 37℃條件下放置1h ；
6 、用PBS衝洗3次 ，每次10min ，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像並拍照 。

​

運輸和保存 ：
視天氣狀況和運輸距離遠近 ，公司與客戶協商後選擇下述方式中的一種進行 。
1)1mL凍存細胞懸液裝於1.8ml的凍存管中 ，置於裝滿幹冰的泡沫保溫盒中進行運輸 ；收到細胞後請盡快解凍複蘇細胞進行培養 ，如無法立刻進行複蘇操作 ，凍存細胞可在-80℃的條件下保存1個月 。
2)T-25培養瓶充滿*培養基後進行常溫運輸 ；收到細胞後請鏡下觀察細胞生長狀態 ，如鋪瓶率超過85%請立即進行傳代操作 ，如懸浮的細胞較多 ，請將培養瓶至於培養箱中靜置過夜以幫助未死亡的懸浮細胞能夠再次貼壁 。

細胞培養的優點 ：
1.研究的對象是活細胞
在實驗過程中 ，根據要求可始終保持細胞活力 ，並可長時間監控 、檢測甚至定量評估一部分活細胞的情況 ，包括活細胞的形態 、結構 、生命活動等 。
2.研究條件可以人為控製
pH 、溫度 、氧氣 、二氧化碳 、張力等物理化學的條件 ，可以根據實際需要進行人為的控製 ，同時 ，可以施加化學 、物理 、生物等因素作為條件而進行實驗觀察 ，這些因素同樣可以處於嚴格控製之下 。
3.研究的樣本可以達到比較均一性
通過細胞培養一定代數後 ，所得到的細胞係則可以達到均一性而屬於同一類型的細胞 ，需要時 ，可采用克隆化等方法使細胞達到純化 。
4.研究內容便於觀察 、檢測和記錄
采用各種研究技術 ：如倒置生物顯微鏡 、熒光顯微鏡 、電子顯微鏡 、流式細胞術 、激光共焦顯微鏡 、免疫組織化學 、原位雜交 、同位素標記等各種儀器設備 。
冷凍保存細胞之方法 ？
冷凍保存方法一: 冷凍管置於4℃ 30~60 分鍾→ （-20 ℃30 分鍾*） → -80 ℃16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 儲存 。
冷凍保存方法二: 冷凍管置於已設定程序之可程序降溫機中每分鍾降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下 ， 再放入液氮槽vapor phase儲存 。*-20 ℃不可超過1 小時 ， 以防止冰晶過大 ，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些 。
培養操作 ：
1）複蘇細胞 ：將含有 1mL 細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍 ，加 入 4mL 培養基混合均 勻 。在 1000RPM 條件下離心 4 分鍾 ，棄去上清液 ，補 加 1-2mL 培養基後吹勻 。然後將所有細胞懸液加入培養瓶中培 養過夜（或將 細胞懸液加入 10cm 皿中 ，加入約 8ml 培養基 ，培養過夜） 。第二天換液並 檢查細胞密度 。
2）細胞傳代 ：如果細胞密度達 80%-90% ，即可進行傳代培養 。      
1. 棄去培養上清 ，用不含鈣 、鎂離子的 PBS 潤洗細胞 1-2 次 。
2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）於培養瓶中 ，置於 37℃培 養箱中消化 1-2 分鍾 ，然後在顯微鏡下觀察細胞消化情況 ，若細胞大部分 變圓並脫落 ，迅速拿回操作台 ，輕敲幾下培養 瓶後加少量培養基終止消 化 。  
3. 按 6-8ml/瓶補加培養基 ，輕輕打勻後吸出 ，在 1000RPM 條件下離心 4 分 鍾 ，棄去上清液 ，補加 1-2mL 培養液後吹勻 。
4. 將細胞懸液按 1 ：2 比例分到新的含 8ml 培養基的新皿中或者瓶中 。
3）細胞凍存 ：待細胞生長狀態良好時 ，可進行細胞凍存 。下麵 T25 瓶為類 ；
1. 細胞凍存時 ，棄去培養基後 ，PBS 清洗一遍後加入 1ml  ，細胞變圓 脫 落後 ，加入 1ml 含血清的培養基終止消化 ，可使用血球計數板計數 。
2. 4 min 1000rpm 離心去掉上清 。加 1ml 血清重懸細胞 ，根據細胞數量加 入血 清和 DMSO ，輕輕混勻 ，DMSO 終濃度為 10% ，細胞密度不低於1x106/ml ，每支凍存管凍存 1ml 細胞懸液 ，注意凍 存管做好標識 。
3. 將凍存管置於程序降溫盒中 ，放入-80 度冰箱 ，2 個小時以後轉入液氮灌儲存 。記錄凍存管位置以便下次拿取。

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