老哥俱乐部

培养操作步骤 ：
1．用盖片镊将盖玻片自75%乙醇中取出，用无菌丝绸布擦拭干净，不要用纱布； 
2．将盖玻片轻轻放入6孔培养板（每孔一片）或培养皿中（每个平皿可放置2-3片）； 
3．在距离紫外灯直射范围内20-30 厘米处照射2-3小时； 
4．将经过计数的细胞悬浮液移入培养板中
，使盖玻片*浸在培养液中； 
5．将培养板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天

，当贴壁细胞生长至覆盖培养板底部2/3面积时，将培养板取出
，用盖片镊轻轻取出盖玻片，用蒸馏水漂洗后即可进行快速固定以及免疫细胞化学检测。 

下列是产品的订购信息：

细胞培养的优点：
1.研究的对象是活细胞
在实验过程中
，根据要求可始终保持细胞活力

，并可长时间监控、检测甚至定量评估一部分活细胞的情况
，包括活细胞的形态、结构、生命活动等。
2.研究条件可以人为控制
pH、温度、氧气、二氧化碳、张力等物理化学的条件，可以根据实际需要进行人为的控制，同时，可以施加化学

、物理、生物等因素作为条件而进行实验观察，这些因素同样可以处于严格控制之下。
3.研究的样本可以达到比较均一性
通过细胞培养一定代数后，所得到的细胞系则可以达到均一性而属于同一类型的细胞，需要时
，可采用克隆化等方法使细胞达到纯化
。
4.研究内容便于观察、检测和记录
采用各种研究技术
：如倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、流式细胞术、激光共焦显微镜、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记等各种仪器设备。
​
实验要点及说明：
1．本方法适用于贴壁细胞培养
，而不适用于悬浮细胞培养，悬浮细胞可使用滴片法
； 
2．所使用的盖玻片应该为优质玻璃，并经过铬酸洗液处理； 
3．盖玻片非常薄，易碎，取放盖玻片时动作要轻； 
4．如果需要更多生长状态一致的细胞，可以使用较大的培养皿，但不宜过大
，以避免培养液的浪费和增加污染机率
； 
5．如果细胞贴壁生长能力较差
，可将盖玻片在0.5%多聚赖氨酸溶液中浸泡5-10分钟并自然晾干。

细胞培养方法：
1、细胞传代：细胞密度达到80-90%时即可传代
①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次
；
②加入2ml0.25%（T25瓶）
，使覆盖整个瓶或皿
，盖好放入培养箱消化；
③1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落
，轻轻吹打下确认消化情况后加入*培养基终止消化；若细胞还是贴壁
，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止
；
④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min
，弃上清；
⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基；
⑥悬浮细胞直接离心收集
，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。
2
、细胞复苏
：
①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，时间1min左右
，加入4-5ml培养基混匀
。
②在1000RPM左右条件下离心4min，弃上清,加1-2ml培养基吹匀，将细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基
。
3、细胞冻存：待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种
①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次
，加入1mL 0.25%（T25瓶）
②1-2min后

，显微镜下观察细胞
，大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入*培养基终止消化
；
③将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清
，加1ml冻存液重悬细胞

；
④将冻存管放入程序降温盒，放入-80℃冰箱，4小时后将冻存管转入液氮罐储存。

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