老哥俱乐部

实验材料与试剂配制

：
1. 仪器与材料
：酶标仪（使用前预热30分钟），微量加液器、吸头、蒸馏水或去离子水

，滤纸
。
2. 缓冲液使用：加5ul 的缓冲液于50ul 的样品中，如果样品量不够或者不确定

，缓冲液和样品的混合比例不要小于1:10即可。
混匀
，静置1小时备用（如果标本是血清或者血浆
，此步骤忽略）。
3. 洗液的配制：按1:100的比例配制洗液备用。
样品收集
、处理及保存
1. 细胞培养上清：适用于检测体外培养的细胞分泌性成份。用无菌管收集细胞上清液
，以1000×g离心15分钟，收集上清。
2. 细胞：用PBS反复洗涤细胞3次，调整细胞浓度达到104-106/ml 左右，通过反复冻融，使细胞破坏并放出细胞内成份，或者细胞超声粉碎，离心取上清液检测
。
3. 血清
：在室温下，血液自然凝固，以1000×g离心15分钟
，取上清待测
。
4. 血浆
：应根据标本的要求选择EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合后静置10-20 分钟后
，以1000×g离心15分钟，收集上
清。
5. 体液：包括胸腹水、脑脊液

，分泌物等
。使用不含热原和内毒素的离心管收集，以1000×g离心15分钟，收集上清。
6. 组织标本：切取组织标本，称取重量0.5mg
，加入500ul 的PBS，用手工或匀浆器，或超声破碎仪将标本匀浆，以2000-3000
rmp离心20 分钟，收集上清进行检测
。
7. 样品中不能含有NaN3
，因NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
8. 保存：如果样品不能立即检测，应将其分装，-70 ℃保存，避免反复冷冻

。保存过程中如出现沉淀，应再次离心
。血液标本尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中含大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻
。
操作步骤
：
1. 取出试剂盒
，室温（20-25℃）放置 30 分钟。
2. 分组：取出 96 孔板，根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数，把剩余的板条继续冷藏处理。分别设标准
品组（6 个浓度）
、空白孔
、待测样品组
。
注：为减少实验误差
，保证准确性，建议设置复孔。
3. 加样
：依照标准品的顺序分别加入 50ul 的标准品溶液于空白微孔中；空白对照孔加入 50ul 的蒸馏水；其余微孔中加入 50ul
的待测样本
。
4. 加酶标溶液：标准品组、待测样本组各孔中加入 100ul 的酶标溶液（空白对照孔除外）。
5. 温育
：酶标板用封板纸密封后，放入湿盒内于 37℃恒温孵育 1 小时。
6. 洗板：用稀释后的洗涤液注满每孔，静置 15-30s，充分清洗酶标板 5 次
，用吸水纸*拍干

。
7. 显色：各孔加入显色剂 A 液 50ul 后，再加入显色剂 B 液 50ul。
8. 终止：25-37℃下避光反应 10-15 分钟，加入 50ul 终止液
。
9. 读板：在 450nm 波长读取各孔的 OD 值
。
注：读板时必须拭干板底残留的液体和手指痕迹
，读板时间控制在终止反应后的 30 分钟内，以免影响准确性
。
注意事项
：
1. 实验操作中必须使用一次性吸头
，避免交叉污染。
2. 加样：加样时，要控制加样速度，避免*孔与后一孔间的时间间隔过大，否则将会导致不同的预孵育时间，从而影响实验的准确性以及重复性。
3. 孵育
：严格按照说明书上规定的孵育时间和温度进行
。
4. 反应时间的控制
：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化，如果颜色较深，请提前加入终止液终止反应
。
5. 建议实验前预测样品含量，如样品浓度过高，应对样品进行稀释
，计算结果时乘以相应的稀释倍数。
6. 建议使用本试剂盒时先做预实验（即先做标准曲线
，试用几个标本），如果对本试剂盒有任何疑问，可和所购经销商沟通，如果因运输过程导致试剂盒失效，可要求调换，但概不承担产品本身以外的任何损失

。
安全性
1． 避免人体直接接触显色剂A、B和终止液。一旦接触到这些液体
，请尽快用水冲洗。
2． 实验中不要进食、抽烟或使用化妆品
。
3． 不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。
保存条件及有效期
：
1.试剂盒保存：2-8℃
2.有效期
：6个
原理:
采用双抗体夹心法测定人雄激素结合蛋白（ABP）水平。用纯化的人雄激素结合蛋白（ABP）抗体包被微孔板，制成固相载体，实验时依次在微孔板中加入样本及标准品，并加入 HRP 标记的 ABP 抗体，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物
，反复洗涤后加底物 TMB 显色。TMB 在过氧化物酶的催化下转化为蓝色，再用硫酸终止反应，转变成黄色。颜色的深浅和样品中的 ABP含量呈正相关。采用酶标仪在 450nm 波长测定吸光度（OD 值），根据标准曲线，计算测试样品中 ABP 浓度。