老哥俱乐部

细胞简介
：

颈动脉存在于脊椎动物颈部的动脉。有颈外动脉和颈内动脉

，前者分布至头顶部和颜面部，后者进入颅内分布至脑和眼眶内。

内皮细胞层是血液和其它组织的天然屏障。内皮细胞功能病变是造成动脉粥样硬化的主要原因。内皮细胞同时会合成和分泌凝血和纤维蛋白溶解系统的增强和抑制物

，以及影响血小板粘附和聚集的媒介物
。它们同时也会分泌控制细胞增殖的蛋白来维持血管壁的健康。内皮细胞会分泌 t-PA和PAI-1等抗血栓因子以及响应TNF-α，继而分泌细胞因子GM-CSF，表达ICAM-1表面抗体，产生大量的一氧化氮和endothelin。原代动脉内皮细胞的体外培养系统有助于在特定的体外条件下研究血管内皮细胞的功能。

细胞特性：

1）或血管假性血友病因子（vWF）荧光染色为阳性
。

3）经鉴定细胞纯度高于90%
。

4）不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原体、、酵母和。

5）细胞生长方式：上皮样，多角形细胞，贴壁培养

。

推荐培养基
：

老哥俱乐部推荐使用 delf原代内皮细胞培养体系 作为体外培养的培养基
。

实验报告：

一、分离与培养：

1
、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次
，将组织剪成1mm3左右大小

；

2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液
，自然沉淀并收集上清
，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置
；

3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织被消化；

4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬
，接种于25cm2培养瓶
，放置于37℃ 
，5％CO2 培养箱中培养；

5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；二、免疫荧光鉴定
：

1
、待心房肌细胞生长至80%融合时
，弃去培养基
，用温育的PBS冲洗细胞2次

，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

2、PBS冲洗细胞2次
，每次10min，然后在4℃条件下
，用0.1％Triton X-100透膜15min
；

3
、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min

；

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜

；

5、PBS冲洗细胞3次
，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；

6、用PBS冲洗3次
，每次10min，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照
。

注意事项：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液
、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和老哥俱乐部联系。

2. 仔细阅读细胞说明书
，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基
、血清比例、所需细胞因子等

，确保细胞培养条件一致

，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题

，责任由客户自行承担。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态
。因运输问题，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片，是正常现象。观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h。

4. 贴壁细胞可以消化
，悬浮细胞直接混匀收集细胞，900 rpm-1000 rpm离心3 min
，弃上清。加5 mL PBS重悬细胞，再900 rpm-1000 rpm离心3 min，，用新鲜的*培养基重悬细胞

，并接种到新的培养瓶或培养皿中，置于培养箱中进行培养
。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片

，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流。由于运输的原因
，个别敏感细胞会出现不稳定的情况

，请及时和老哥俱乐部联系

，告知细胞的具体情况，以便老哥俱乐部的技术人员跟踪回访直至问题解决
。

7. 该细胞仅供科研使用。

8. 备注：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞。收到细胞后次传代建议1：2传代 。

9.注意
： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿。不是1个T25瓶传2个10cm皿。

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