老哥俱乐部

实验报告：

一、分离与培养：

1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次
，将组织剪成1mm3左右大小；

2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶），混悬10s
，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清
，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置

；

3
、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s
，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织被消化；

4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min
，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；

5、差速贴壁1h后，吸出培养基

，按实验需要接种于6孔板中继续培养；二、免疫荧光鉴定
：

1
、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基


，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min
；

2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS冲洗细胞2次
，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜
；

5
、PBS冲洗细胞3次，每次10min
，按1
：150的比例稀释抗α-actin的二抗
， 37℃条件下放置1h；

6、用PBS冲洗3次，每次10min，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

细胞简介：

中耳位于外耳和内耳之间
，主要结构是鼓膜和听骨链
。中耳内部不规则中空的结构表面覆盖着一层上皮组织，起到物理保护的作用。

细胞特性：

1）细胞来源于实验动物的正常中耳组织。

2)细胞鉴定
：广谱角蛋白((Pan Cytokeratin)荧光染色为阳性
。

3)经鉴定细胞纯度高于90%
。

4)不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原体、、酵母和。

5)细胞生长方式：上皮样细胞，贴壁培养。

推荐培养基
：

老哥俱乐部推荐使用 DELF 原代上皮细胞培养体系 作为体外培养的培养基。

公司正在出售的产品：

大鼠过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(PPARγC1α)检测试剂盒 
，英文名： PPARγC1α ELISA Kit

Rat 6 keto prostaglandin F1a (6-keto-PGF1a) ELISA Kit 大鼠6酮前列腺素F1a(6-keto-PGF1a)检测试剂盒

RatAi-glucoprotein210,GP210ELISAKit 大鼠抗核膜糖蛋白210抗体(gp210)检测试剂盒 进口分装

CLIAKitforeNOSELISAKit大鼠内皮型合成酶

细胞氯乙酰基转移酶(CAT)报告基因活性同位素薄层色谱(TLC)检测试剂盒20次

RatLeptospiraIgG,LepIgGELISAKit大鼠钩端IgG(LepIgG)检测试剂盒

HA重组甲型流感 H11N9 (A/mallard/Alberta/294/1977) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 蛋白 (His 标签) Protein

ShK(Stichodactyla helianthus Neurotoxin 0.1mgShK(Stichodactyla helianthus Neurotoxin)-(Dap22) 海葵神经毒素(35肽)

S100A9重组人 S100A9 / CAGB / P14 蛋白 Protein

AMTN Protein Human 重组人 AMTN / Amelotin 蛋白

LXN Protein Human 重组人 Latexin / LXN / TCI 蛋白

ShK(Stichodactyla helianthus Neurotoxin 0.1mgShK(Stichodactyla helianthus Neurotoxin)-(Dap22) 海葵神经毒素(35肽)

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猪肺表面活性物质相关蛋白A(SP-A)ELISA 试剂盒

Human a disiegrin and metalloproteinase 8 (ADAM8) ELISA Kit 人解整合素样金属蛋白酶8(ADAM8)检测试剂盒

Porcineniicoxide,NOELISAKit 猪血清(NO)检测试剂盒 进口分装

CLIAKitforAlpha2-PI(HumanAlpha2-plasmininhititor)ELISAKit人α2纤溶酶抑制物

血液酪酶(tyrosinase)活性比色法定量检测试剂盒20次

NudeMouseClaracellprotein,CC16ELISAKit裸鼠克拉拉细胞蛋白(CC16)检测试剂盒

兔中耳上皮细胞猪白介素2(IL-2)检测试剂盒     试剂盒   组装/原装

猪白介素1受体拮抗剂(IL1Ra)检测试剂盒     试剂盒   组装/原装

猪白介素1β(IL-1β)检测试剂盒     试剂盒   组装/原装

猪白介素1α(IL-1α)检测试剂盒     试剂盒   组装/原装

注意事项：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和老哥俱乐部联系。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息
，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等

，确保细胞培养条件一致，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题
，责任由客户自行承担。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态。因运输问题
，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片，是正常现象。观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h。

4. 贴壁细胞可以消化，悬浮细胞直接混匀收集细胞，900 rpm-1000 rpm离心3 min
，弃上清
。加5 mL PBS重悬细胞，再900 rpm-1000 rpm离心3 min，
，用新鲜的*培养基重悬细胞
，并接种到新的培养瓶或培养皿中，置于培养箱中进行培养。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流。由于运输的原因
，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和老哥俱乐部联系，告知细胞的具体情况
，以便老哥俱乐部的技术人员跟踪回访直至问题解决。

7. 该细胞仅供科研使用。

8. 备注：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞

。收到细胞后次传代建议1：2传代
。

9.注意
： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿。不是1个T25瓶传2个10cm皿

。