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如何使用熒光定量RT-PCR試劑盒進行實驗
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：144 更新時間
：2024-08-19
使用熒光定量RT-PCR試劑盒進行實驗是一個複雜但精確的過程
，涉及多個關鍵步驟
。以下是一個詳細的實驗流程
，旨在指導如何正確使用該試劑盒進行RNA的檢測和定量分析
。
一
、實驗前準備
1.了解試劑盒信息
：首先
，仔細閱讀試劑盒的說明書，了解試劑盒的組成
、儲存條件、有效期以及實驗所需的設備和試劑
。
2.實驗設備和試劑準備
：
-熒光定量PCR儀：確保儀器已經過校準，並熟悉其操作界麵
。
-微量移液器
、離心機
、渦旋振蕩器
、分光光度計等實驗設備
。
-無RNA酶的離心管
、槍頭
、EP管等耗材
。
-試劑包括RNA提取試劑（如RNAiso Plus）
、氯仿
、異丙醇
、75%乙醇（DEPC水配製）
、反轉錄試劑
、qPCR反應液等
。
二、實驗步驟
1.細胞總RNA提取
1.細胞裂解
：對於貼壁細胞
，棄去培養液後
，用PBS清洗一次
，加入適量RNA提取試劑（如RNAiso Plus）
，吹打均勻後室溫靜置5分鍾
。
2.兩相分離
：加入適量的氯仿（如每1ml RNAiso Plus加入200μl氯仿）
，劇烈振蕩後室溫靜置5分鍾
，然後4℃離心15分鍾（12000G）
。此時
，混合物將分為三層
，RNA主要在水相上層
。
3.RNA沉澱
：小心吸取上層水相轉移至新的無RNA酶離心管中
，加入等體積的異丙醇
，混勻後室溫靜置10分鍾
，再4℃離心10分鍾（12000G）
。此時
，RNA將在管底部形成膠狀沉澱
。
4.RNA清洗
：棄去上清
，加入適量的75%乙醇（用DEPC水配製）
，輕輕上下顛倒混勻
，4℃離心5分鍾（7000rpm）
，重複清洗1-2次
。
5.RNA幹燥與溶解
：小心吸去乙醇
，室溫幹燥RNA沉澱5-10分鍾
，避免過分幹燥
。然後加入適量的無RNA酶水溶解RNA
，保存於-80℃備用
。
2.RNA濃度和純度測定
使用分光光度計測定RNA溶液在260nm和280nm處的吸光度值
，計算RNA的濃度和純度（A260/A280比值應接近2.0）
。
3.反轉錄合成cDNA
根據反轉錄試劑盒的說明書
，將RNA反轉錄成cDNA
。這通常涉及在RNA溶液中加入反轉錄酶
、引物和其他必要組分
，然後在適當的溫度下孵育一段時間
。
4.qPCR實驗
1.配置qPCR反應液
：按照試劑盒說明書
，將qPCR反應液的各組分按比例混合
，並加入適量的cDNA模板
。
2.點板
：將配置好的qPCR反應液加入96孔板或八聯管中
，注意避免氣泡和液滴貼壁
。
3.上機檢測
：將加好樣的孔板或八聯管放入熒光定量PCR儀中，設置合適的反應條件（如溫度循環和熒光信號采集模式）
，開始實驗。
4.數據分析
：實驗結束後
，收集並分析熒光信號數據
，根據標準曲線或CT值計算目標基因的相對表達量
。
三
、注意事項
1.避免汙染
：整個實驗過程中應嚴格遵循無RNA酶操作原則
，防止RNA降解和汙染
。
2.精確操作
：在加樣
、離心等步驟中
，應精確控製體積和時間
，確保實驗結果的可重複性
。
3.設備校準
：定期對熒光定量PCR儀等實驗設備進行校準和維護
，確保儀器的準確性和穩定性
。
4.儲存條件
：試劑盒和試劑應儲存在推薦的溫度下（通常為2-8℃或-20℃）
，避免光照和反複凍融
。
使用熒光定量RT-PCR試劑盒進行實驗需要嚴格遵循實驗步驟和注意事項
，以確保實驗結果的準確性和可靠性
。
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