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ELISA試劑盒的底物
點擊次數 :953 更新時間 :2016-10-24

(一)AP的底物
AP為磷酸酯酶 ,一般采用對硝基苯磷酸酯(p-nitrophenylphosphate,p-NPP)作為底物 ,可製成片劑 ,使用方便 。產物為黃色的對硝基酚 ,在405nm波長處有吸收峰 。用NaOH終止酶反應後 ,黃色可穩定一時間 。
AP也有發熒光底物(磷酸4-甲基傘酮) ,可用於ELISA作熒光測定 ,敏感度較高於用顯色底物的比色法 。

(二)ELISA試劑盒HRP的底物
HRP催化過氧化物的氧化反應 ,代表性的過氧化物為H2O2 ,其反應式如下 :
DH2+H2O2D+H2O
上式中 ,DH2為供氧體 ,H2O2為受氫體 。在ELISA中 ,DH2一般為無色化合物 ,經酶作用後成為有色的產物 ,以便作比色測定 。常用的供氫體有鄰苯二胺(O-phenylenediamine,OPD) 、四甲基聯苯胺(3,3,5,5-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS[2,2-azino-di-(3-ethylbenziazobinesulfonate-6)] 。
OPD氧化後的產物呈橙紅色 ,用酸終止酶反應後 ,在492nm處有zui高吸收峰 ,靈敏度高 ,比色方便 ,是HRP結合物zui常用的底物 。OPD本身難溶於水 ,OPD·2HCl為水溶性 。曾有報道OPD有致異變性 ,操作時應予注意 。OPD見光易變質 ,與過氧化氫混合成底物應用液後更不穩定 ,須現配置現用 。在試劑盒中 ,OPD和H2O2一般分成二組分 ,OPD可製成一定量的粉劑或片劑形式 ,片劑中含有發泡助溶劑 ,使用更為方便 。過氧化氫則配入底物緩衝液中 ,有製成易保存的濃縮液 ,使用時用蒸餾水稀釋 。先進的ELISA試劑盒中則直接配成含保護劑的工作濃度為0.02%H2O2的應用液,隻需加入OPD後即可作為底物應用液 。
TMB經HRP作用後共產物顯藍色 ,目視對比鮮明 。TMB性質較穩定 ,可配成溶液試劑 ,隻需與H2O2溶液混和即成應用液 ,可直接作底物使用 。另外 ,TMB又有無致癌性等優點 ,因此在ELISA中應用日趨廣泛 。酶反應用HCL或H2SO4終止後 ,TMB產物由藍色呈黃色 ,可在比色計中定量 ,zui適吸收波長為405nm 。
ABTS雖不如OPD和TMB敏感 ,但空白值極低 ,也為一些ELISA試劑盒所采用 。
另一種HRP的底物為3-(4-羥基)苯丙酸[3-(4-hydroxy)phenlypropionicacid,HPPA] ,經HRP作用後 ,產物顯熒光 ,可用熒光光度計測量 。用於ELISA的優點為可加寬定量測定的線性範圍 。
HRP對氫受體的專一性很高 ,僅作用於H2O2 、小分醇的過氧化物和尿素過氧化物(ureaperoxide) 。H2O2應用zui多 ,但尿素過氧化物為固體 ,作為試劑較H2O2方便 、穩定 。試劑盒供應尿素過氧化物片劑 ,用蒸餾水溶解後 ,在底物緩衝液中密閉 、低溫(2~8℃)可穩定1年 。
 

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