標本的采集與保存:
1. 血清 :
將收集於血清分離管的全血標本在室溫放置 2 小時或 4oC 過夜 ,然後 1000×g 離心 20 分鍾 ,取上清即可 ,或將上清置於-20oC 或-80oC 保存 ,但應避免反複凍融 。
2. 血漿 :
用 EDTA 或肝素作為抗凝劑采集標本 ,並將標本在采集後的 30 分鍾內於 2-8oC 1000×g 離心 15 分鍾 ,取上清即可檢測 ,或將上清置於-20oC或-80oC 保存 ,但應避免反複凍融 。
3. 組織勻漿 :
1) 取適量組織塊 ,於預冷PBS(0.01mol/L, pH 7.0-7.2)中清洗去除血液 ,稱重後備用(組織塊較大需先剪碎後再勻漿) ;
2) 可同時選用多種勻漿方法達到較好的破碎效果 :首先將組織塊移入玻璃勻漿器 ,加入5-10mL 預冷PBS 進行充分研磨 ,該過程需在冰上進行(有條件實驗室可選用機器勻漿) ;得到的勻漿液可再利用超聲破碎或反複凍融 進一步處理(超聲破碎過程中注意冰浴降溫 ;反複凍融法可重複2次) 。
3) 將製備好的勻漿液於5000×g 離心5 分鍾 ,留取上清即可檢測 。
4. 細胞裂解液 :
1)貼壁細胞需要先用yi酶消化 ,離心收集細胞(懸浮細胞可直接離心收集) ;
2)將收集到的細胞用冷PBS 洗3 次 ;
3)物理方法裂解細胞(可先超聲破碎細胞 ,再反複凍融) :
i 超聲破碎 :取適量PBS 重懸細胞 ,用一定功率的超聲波處理細胞懸液 ,使細胞急劇震蕩破裂 。
ii 反複凍融 :將待破碎的細胞在-20 oC 以下冰凍 ,室溫融解 ,反複3 次,使細胞溶脹破碎 。
4)將標本於2-8 oC 1500×g 離心10 分鍾 ,收集上清備用 。
5. 細胞培養上清或其它生物標本 :
請 1000×g 離心 20 分鍾 ,取上清即可檢測 ,或將上清置於-20oC 或-80oC 保存 ,但應避免反複凍融 。
注意 :
1. 以上標本均需密封保存 ,4oC保存應小於1周 ,-20oC不應超過1個月,-80oC不應超過2個月 。
2. 標本使用前應緩慢均衡至室溫 ,不應加熱使之融解 。
3. 實驗前紅細胞裂解液必須用標準品稀釋液稀釋。
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