溫和氣單胞菌PCR試劑盒反應五要素 ：

參加PCR反應的物質主要有五種即引物 、酶 、dNTP 、模板和Mg2+

引物 ：引物是PCR特異性反應的關鍵 ，PCR 產物的特異性取決於引物與模板DNA互補的程度 。理論上 ，隻要知道任何一段模板DNA序列 ， 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物 ，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增 。設計引物應遵循以下原則 ：

①引物長度 ： 15-30bp ，常用為20bp左右 。

②引物擴增跨度 ： 以200-500bp為宜 ，特定條件下可擴增長至10kb的片段 。

③引物堿基 ：G+C含量以40-60%為宜 ，G+C太少擴增效果不佳 ，G+C過多易出現非特異條帶 。ATGC*隨機分布 ，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列 。

④避免引物內部出現二級結構 ，避免兩條引物間互補 ，特別是3'端的互補 ，否則會形成引物二聚體 ，產生非特異的擴增條帶 。

⑤引物3'端的堿基 ，特別是末及倒數第二個堿基 ，應嚴格要求配對 ，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗 。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點 ， 被擴增的靶序列*有適宜的酶切位點 ， 這對酶切分析或分子克隆很有好處 。

⑦引物的特異性 ：引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性 。

引物量 ：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol ，以*引物量產生所需要的結果為好 ，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增 ，且可增加引物之間形成二聚體的機會 。

組成及試劑配製:

1、酶標板 ：一塊（96孔）

2 、 標準品（凍幹品） ： 2瓶 ，請臨用前15分鍾內配製 。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml ，蓋好後室溫靜置大約10分鍾 ，同時反複顛倒/搓動以助溶解 ，其濃度為200 U/L ，然後做係列倍比稀釋（注 ：不要直接在板中進行倍比稀釋） ，分別配製成200 U/L ，100 U/L ，50 U/L ，25 U/L ，12.5 U/L ，6.25 U/L ，3.12 U/L ，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L 。如配製100 U/L標準品 ：取0.3ml （不要少於0.3ml ）200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中 ，混勻即可 ，其餘濃度以此類推 。

3 、 樣品稀釋液 ：1×20ml 。

4 、 檢測稀釋液A ：1×10ml 。

5 、 檢測稀釋液B ：1×10ml 。

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