1.標準品的加樣 ：設置標準品孔和樣本孔 ，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL ； 。
2.加樣 ：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑 ，其餘各步操作相同） 、待測樣品孔 。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl ，然後再加待測樣品10μl（樣品終稀釋度為5倍） 。加樣將樣品加於酶標板孔底部 ，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻 。
3.加酶 ：每孔加入酶標試劑100μl ，空白孔除外 。
4.溫育 ：用封板膜封板後置37℃溫育60分鍾 。
5.配液 ：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋後備用 。
6.洗滌 ：小心揭掉封板膜 ，棄去液體 ，甩幹 ，每孔加滿洗滌液 ，靜置30秒後棄去 ，如此重複5次 ，拍幹 。
7.顯色 ：每孔先加入顯色劑A50μl ，再加入顯色劑B50μl ，輕輕震蕩混勻 ，37℃避光顯色15分鍾. 
8.終止 ：每孔加終止液50μl ，終止反應（此時藍色立轉黃色） 。
9.測定 ：以空白孔調零 ，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值） 。 測定應在加終止液後15分鍾以內進行 。

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