ELISA試劑盒HRP的製備方法

1).硫酸銨分級分離 ：在不斷攪拌下 ，每1000mL濾液中慢慢加入226g硫酸銨粉末(相當於0.40飽和度 ，0℃) ，大約在1~2h內加完 ，置冷室中放置過一夜 。次日將上清液小心地用虹吸管移出 ，下麵混濁液以3 000r/min離心15min ，棄沉澱 ，合並上清液 。再按每1000mL上清液加258g硫酸銨粉末(0.8飽和度)隨加隨攪拌 ，當硫酸銨全部溶解後 ，置冷室過一夜 。次日 ，虹吸出上清液 ，沉澱部分在冰凍離心機中以13000r/min離心20min ，棄去上清液 ，收集沉澱 。將沉澱懸浮於100~150mL蒸餾水中(加水量要使沉澱全部溶解為止) ，分裝於透析袋內 ，放在流動自來水中進行透析1～2天 ，直到硫酸銨透析完畢為止(可用5%乙酸鋇溶液或奈氏試劑進行檢查) 。然後改換成用蒸餾水透析 ，中間更換2~3次 ，用0.1mol/L溶液檢查透析外液無氯離子為止 。將透析液合並 ，在冰凍離心機中以4 000r/min離心15min ，棄去沉澱 ，量上清液的體積 。

2).丙酮分級分離 ：將上清液倒入燒杯並置冰鹽浴中 ，在不斷攪拌下 ，用細滴管沿杯壁加入1倍體積預冷至-15℃的丙酮 ，放置片刻，在冰凍離心機中以4000r/min離心15min ，棄去沉澱 。上清液再加入0.8體積(按原上清液體積)-15℃丙酮 ，(操作同上) ，靜置後 ，在冰凍離心機中離心收集沉澱 。將沉澱溶於少量蒸餾水中 ，透析除去丙酮 。可得RZ值近於1的酶溶液 。

3).水提取 ：稱取5kg用水衝刷幹淨的鮮辣根(辣根皮中亦含有豐富的HRP) ，用菜刀切成小碎塊 ，在絞肉機中絞碎1～2次 。碎渣漿用1倍體積的水低溫下攪拌提取過一夜(亦可采用高速抽提法) 。次日用甩幹機(或離心機)甩幹 ，收集濾液 ，碎渣再用1/4倍體積水浸泡提取1次 ，合並2次濾液 ，測得總體積 。

4).精製 ：將上步酶液適當稀釋 ，滴加1mol/L硫酸鋅溶液 ，使酶液中鋅離子濃度為10 -3 mol/L ，5 000r/min離心10min ，得上清液 。再將沉澱用少量蒸餾水洗滌 ，離心 ，洗液與清液合並 ，分裝於透析袋內 ，用水透析除鹽 ，用微孔濾膜過濾，進行真空冰凍幹燥(約得20mg) ，產品呈米黃色纖維狀鬆軟物 ，HRP產品的RZ值可達3.0左右 ，置真空幹燥器中低溫保存 。

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