供氫體的種類很多 ，形成的產物特點不一 。如DAB(3.3-二氨基聯苯胺)的反應產物為不溶性沉澱物 ，並有電子密度 ，故適宜於做免疫酶染色或電鏡觀察 。S(5-氨基水楊酸)早期曾用於ELISA ，但其溶解度不夠大 ，且空白孔不易控製到無色 ，現已很少應用 。OT(鄰聯甲苯胺)的特點是能產生鮮豔的藍綠色產物且靈敏度較高 ，但反應中受溫度影響較大 ，而且由於產物不穩定 ，需要在短時間內進行測定 。目前用得較廣泛和較滿意的供氫體是 ：OPD(鄰苯二胺)和TMB(四甲基聯苯胺) 。前者形成的產物為深桔黃色或棕色 ，後者產物為藍綠色 ，二者的可溶性均好 ，在避光處顏色穩定 ，空白可近於無色 ，靈敏度上據報道後者比前者可高4倍以上 。另外 ，還有一種供氫體稱ABTS[2, 2-邊氮基-雙(3-乙基苯並噻吡咯啉-6磺酸)] ，其反應產物呈藍綠色 ，且靈敏度和穩定性均好 。尤其是在致癌的潛在可能性方麵 ，ABTS與TMB皆是值得被優選的供氫體 。
在不斷攪拌下，每1000mL濾液中慢慢加入226g硫酸銨粉末(相當於0.40飽和度
，0℃)
，大約在1~2h內加完
，置冷室中放置過夜
。次日將上清液小心地用虹吸管移出
，下麵混濁液以3 000r/min離心15min
，棄沉澱
，合並上清液
。再按每1000mL上清液加258g硫酸銨粉末(0.8飽和度)隨加隨攪拌
，當硫酸銨全部溶解後
，置冷室過夜
。次日
，虹吸出上清液
，沉澱部分在冰凍離心機中以13000r/min離心20min，棄去上清液
，收集沉澱
。
由於HRP的底物H2O2本身又是酶的抑製劑
，因此酶促反應中使用的H2O2不能過量
。應控製在經較短時間反應後呈色即達高峰(說明H2O2已消耗殆盡)
。這樣即使再延長時間也不會增加反應產物的顏色
。