檢測夾心法定量蛋白方法 

   測定前提的優化用棋盤測定法測定5ng/ml的rhGM-CSF/IL-3 ，表明hGM-CSFMcAb的濃度為10μg/ml ，rhIL-3PcAb的稀釋度為1:100 。但目前尚無一簡便有效的檢測方法對rhGM-CSF/IL-3進行定量檢測 。100μl可以產生足夠陡的劑量反應曲線 ，且本底低 ，是反應體積 。為了進一步研究其在體內的藥效以及藥代動力 ，必需對其進行定量測定 。綜上所述 ，本試驗建立的ELISA夾心法檢測速度快 、重複性好 、敏捷度高 、特異性好 ，可對樣品濃度低至50pg/ml進行定量測定 ，幾乎不受其它生物活性物質及血清成分的幹擾 ，是對rhGM-CSF/IL-3進行有效檢測的好方法 。

大腸杆菌表達的重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子/白細胞介素-3（rhGM-CSF/IL-3）融合蛋白進行了中試純化研究 ，進一步的研究表明rhGM-CSF/IL-3體外能促造血祖細胞的生長發育 ，具有較好的開發應用遠景 。基於rhGM-CSF/IL-3的免疫特性 ，本文建立了ELISA夾心法定量檢測rhGM-CSF/IL-3 。ELISA夾心法測定rhGM-CSF/IL-3融合蛋白 ，用250mmol/L磷酸鹽緩衝液（PBS pH8.0）按適當比例稀釋的rhGM-CSF McAb100μl包被微孔板 ，20℃16h ，將A液（0.1%Tween-20的PBS）洗板5次 ，加200μl1%BSA-PBS溶液206h ，A液洗板 ，甩幹 ，-20℃保留備用 。當rhGM-CSF/IL-3濃度在0.49～6.25ng/ml時呈線性關係 ，回歸係數為r=0.995 ，建立的方法與各種血液組份和細胞因子無交叉反應 ，敏捷度49pg/ml ，批內變異係數為5.96% ，批間變異係數為7.08% 。使用時解凍 ，每孔加樣本100μl ，4℃16h;A液洗板5次 ，加B液（0.1%Tweem-20 ，0.1%BSA in50mmol/L PBS ，pH7.3）適當稀釋的rhIL-3PcAb100μl1h;A液洗板5次 ，加100μl HRP-羊抗兔IgG，37℃1h;A液洗板 ，加100μl OPD顯色液（1mg/ml鄰苯二胺 ，0.012%H 2 O 2  ，100mmol/L檸檬酸-磷酸緩衝液 ，pH5.0） ，30min後用2mol/L H 2 SO 4 100μl終止反應 ，用酶標儀檢測OD 490nm 值 。

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