錯配修複基因超家族屬於管家基因 ,目前已發現人類6個錯配修複基因 :hMSH2 、hMSH3 、hMSH6 、hMLH1、hPMS1和hPMS2 。錯配修複基因的異常表現為基因突變和蛋白質表達的減步 ,而蛋白質表達涉及RNA水平和蛋白質水平 。下麵就RNA水平作一簡要闡述 。
錯配修複基因mRNA原位雜交 :
【材料】
蓋玻片 、濕盒 、雜交爐 、PBS 、SSC、預雜交液 、BcIP/NBT 。
【操作程序】
1.將細胞製成1~107/L細胞懸液,將細胞懸液一滴接種於已消毒培養皿中的蓋玻片上 ,加培養基培養48小時 。
2.將細胞生長狀態良好的蓋玻片取出0.01mol/L PBS漂洗3次 ,甲醇 :丙酮(1 :1)固定液固定10分鍾 ,PBS漂洗3次。
3.將製好的細胞片用10mg/ml蛋白酶K消化 ,37℃ ,10分鍾 ,PBS洗2次 ,每次2分鍾 。
4.取200μl預雜交液95℃變性10分鍾 ,冰浴中驟冷 ,加樣於細胞標本上.平放入密封濕盒.42℃孵育3小時 。
5.標記探針加於200μl預雜交液中,95℃變性10分鍾 ,冰浴中驟冷 ,加樣於細胞標本上 ,平放入密封濕盒 ,42℃恒溫過夜 。
6.依次用6 xSSC-45%甲酰胺洗10分鍾 ,2×SSC洗10分鍾×2次 ,0.2xSSC洗10分鍾×2次 。
7.加堿性磷酸酶標記的抗體 ,37℃ ,4小時 。
8.洗脫液洗10分鍾 ,加入BCIP/NBT顯色 。鏡檢顯況 ,PBS衝洗 ,終止顯色 。
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